谈甜菜红苷对人结肠癌ht29 细胞凋亡的影响

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1、谈甜菜红苷对人结肠癌HT29细胞凋亡的影响一直以来，结肠癌居于各种恶性肿瘤发病率的第2位和病死率的第4位。目前，以氟尿嘧啶为基础的治疗方案仍是结肠癌的国际标准化疗方案，但由于化疗药物的耐药性和药物毒性，该类治疗方案的总体有效率仍不足40%，因此需要开发新药物来提高治疗有效率，同时降低不良反应。中药半枝莲又名太阳花，是马齿觅科马齿觅属一年生肉质草本植物，在我国各地广泛栽培，是典型的合成甜菜素类植物。半枝莲在传统医学中长期被用于治疗结、直肠癌，但其抗癌主要成分及机制至今仍不明确。有报道，半枝莲通过正交设计法

2、优化提取物制备出的红色素，经溶解性观察、薄层色谱法和紫外可见光谱扫描分析证实，该红色素即为甜菜红素。而甜菜红素主要以甜菜红苷形式存在，提取率为7.44%。甜菜红苷作为半枝莲的主要提取物，具有较强的清除氧自由基、羟自由基、二苯代苦味酰基自由基的能力，具有较强的抗氧化、抗肿瘤功效。笔者拟探讨甜菜红苷的抗癌作用及机制，以期为后续研究提供试验依据。　　1材料　　1.1仪器　　PX-150B型生化培养箱(美国BD公司);RZ-9802型酶标仪(天津瑞泽分析仪器有限公司);CR21型高速冷冻离心机(日本Hitach

3、i公司);MCO-175型细胞培养箱(日本Sanyo公司);6HT2L型流式细胞仪(美国GuavaEasyCyte公司);RE-2000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DLSB-5/20型低温冷却循环泵(郑州长城科工贸有限公司);B-290型实验室小型喷雾干燥机(瑞士Buchi公司);GST-1型聚合酶链反应(PCR)仪(英国Gstorm公司);GelDOC2000型凝胶成像分析系统、APC300型电泳仪(美国Bio-Rad公司);DU-650型蛋白核酸分析仪(美国Beckman公司)。　　1.2药

4、品与试剂　　甜菜红苷(郑州郑亚化工产品有限公司，批号：TC326540，纯度：99%);青霉素-链霉素溶液(批号：TBB002)、胎牛血清均购自上海尚善生物科技有限公司;Bcl-2和Bax抗体(美国CST公司);RPMI1640培养液、0.5%二甲基亚砜(DMSO，德国TT(美国Sigma公司);E-ELN-M0044酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司);AnnexinⅤ凋亡试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司);含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、Caspas

5、e-9试剂盒(美国Invitrogen公司);实时荧光(RT)试剂盒、Trizol洗细胞溶液、PCR试剂盒(北京Promega公司);Taq聚合酶、RNase抑制剂(大连宝生物工程有限公司)。　　1.3细胞　　人结肠癌HT29细胞(广州行知生物科技有限公司，批号：AA-CELL-103)。　　2方法　　2.1细胞培养　　HT29细胞置于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的培养液中，在37℃、5%CO2条件下常规培养。　　2.2细胞抑制率的测定　　取对数生长期的HT29细

6、胞，用RPMI1640培养液调整细胞密度至1105ml-1，接种于96孔培养板中，每孔0.1ml，移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。以0(空白对照)、0.5、1、1.5、2、3mg/ml甜菜红苷培养细胞24h;以1.5mg/ml甜菜红苷分别培养细胞0(空白对照)、1、3、6、12、24h。药物培养结束后吸弃各孔中培养液，每孔加入0.1mlMTT[含5%磷酸盐缓冲液(PBS)]，在37℃下继续培养4h。再吸弃各孔中培养液，加入0.5%DMSO0.1ml，振荡摇匀，室温放置10min。以上试验每个质量浓度均

7、设12个复孔。在0.1mlDMSO中发现蓝紫色的MTT甲臜沉淀物，使用ELISA法以酶标仪于570nm波长处测定光密度(OD)，计算细胞抑制率(%)=(空白对照OD-试验OD)/空白对照OD100%。　　2.3细胞凋亡率的测定　　取对数生长期的HT29细胞，用RPMI1640培养液调整细胞密度至1105ml-1，接种于96孔培养板中，每孔0.1ml，移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。以0(空白对照)、1、1.5、2mg/ml甜菜红苷培养细胞24h后，每孔悬浮细胞(贴壁细胞先用0.25%胰酶消化)用PBS

8、洗2次，加入100μlBindingBuffer和FITC标记的AnnexinⅤ(20μg/ml)10μl，室温避光30min，再加入碘化丙啶(PI，50μg/ml)5μl，避光反应5min后，加入400μlBindingBuffer，采用流式细胞仪定量检测，计算凋亡率。　　2.4Caspase活性的测定　　细胞培养与给药同2.3项下方法。用裂解液在冰上放置30min，裂解细胞，以离心半径14cm、160