大蒜素对人结肠癌ht29细胞增殖影响及作用机制研究

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1、大蒜素对人结肠癌HT29细胞增殖影响及作用机制研究作者：王旭平　赵玲　王容郭锋辛华【摘要】　　目的：探讨大蒜素对体外培养结肠癌HT29细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定不同浓度大蒜素对HT29细胞增殖抑制率；流式细胞术测定细胞周期变化及凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax的表达。结果：MTT显示大蒜素能抑制人结肠癌HT29细胞的增殖，并具有时间-剂量依赖性；流式细胞术测定结果显示10μg/ml大蒜素可明显诱导HT29细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G2/M期；可降低癌基因蛋白Bcl表达，而促进Bax表达。结论：大蒜素对人结肠癌HT2

2、9细胞增殖具有抑制作用，可能与细胞周期阻滞和凋亡相关蛋白表达有关。【关键词】大蒜素　结肠癌细胞系T29　凋亡　流式细胞术【ABSTRACT】Objective:TostudytheaffectionofDiallyltrisulfideonculturedhumancoloncarcinomacelllineHT-29anditsmechanism.Methods:TheviabilityofcellsaftervarioustreatmentsinedusingthemethodofMTT.FloetryancoloncarcinomaHT-29cellsed

3、ependence.FloetryresultsshoLfor12hand24h,thepercentageofG0/G1phasecellsancoloncarcinomacelllineHT-29·Apoptosis·Floetry大蒜素是一种从大蒜鳞茎中分离出的具有多种生物学活性的化合物，其化学名为二烯丙基三硫化物。现代医学研究证实大蒜素具有抗菌、消炎、提高机体免疫力和抗肿瘤的作用［1-3］。体外研究显示,大蒜素可以通过诱导癌细胞（如胃癌、前列腺癌）生成活性氧（ROS），上调Bax，Bak和激活Caspase3等方式促进其凋亡［1，4，5］，但大蒜素对结肠

4、癌作用的研究较少。本研究以体外培养的结肠癌HT29细胞为材料，探讨大蒜素对结肠癌细胞增殖的影响并探讨其机制，以期为结肠癌的防治提供实验依据。1　材料与方法1.1　材料　人结肠癌HT29细胞由山东大学医学院细胞生物学研究所提供；大蒜素（二烯丙基代磺酸酯）为上海禾丰制药有限公司生产；MTT、二甲基亚砜（DMSO）、Ho33342、碘化丙啶（PI）为美国Sigma产品；DMEM、新生牛血清为美国Gibco产品；Bcl-2、Bax单克隆抗体购自美国BD公司。1.2　方法1.2.1　细胞培养　人结肠癌HT29细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液，于37℃、5%CO2饱和

5、湿度条件下静置培养。选择对数生长期细胞进行分组实验。1.2.2　MTT法检测大蒜素对细胞增殖的影响　细胞以5×104ml-1的密度接种于96孔培养板中，培养48h后，每孔加入不同浓度的大蒜素各100μl,终浓度分别为1、5、10、20μg/ml，对照组加入含10%FBS的培养基，分别培养12、24、48h后，分别向每孔加入20μlMTT（5mg/ml）溶液，继续培养4h，弃培养液，每孔加入DMSO100μl，脱色摇床振荡5min；酶标仪检测（吸光度为570nm）。每时间浓度组设3个复孔,实验重复3次。所得OD值根据公式计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（1-OD

6、实验组/OD正常组）×100%，以空白组OD值调零。1.2.3　大蒜素诱导结肠癌HT29细胞凋亡最适浓度筛选　以上各实验组加入大蒜素作用24h，加入Ho33342（终浓度10μg/ml）37℃温育20min，再加入PI（终浓度50μg/ml），荧光显微镜观察并记录图象。1.2.4　细胞形态学观察　10μg/ml大蒜素分别作用0~24h，每隔2h倒置相差显微镜观察一次，随机选取视野记录图象。1.2.5　流式细胞仪检测大蒜素对细胞周期的影响细胞以5×104ml-1接种于25cm2培养瓶中,培养48h后，加入10μg/ml大蒜素，分别培养12、24h，弃培养液，加入0

7、.25%胰蛋白酶消化，1000r/min离心8min收集细胞。细胞用PBS清洗3次后，500μlPBS悬浮细胞，加入含10μg/ml的RNase的PI，4℃染色30min。经200目滤网过滤后，上机检测。实验结果采用Modifit软件进行细胞周期各期的百分率及亚二倍体的百分率分析。实验重复3次。1.2.6　流式细胞仪检测大蒜素对Bcl-2和Bax的影响　细胞以5×104ml-1接种于25cm2培养瓶中,培养48h后，加入10μg/ml大蒜素分别培养12和24h，收集细胞，以PBS清洗3次，70%乙醇4℃固定1h。经PBS再次清洗后，不同时间组细胞分别加入兔抗人B

8、cl-2或兔抗人Bax一