资源描述：
《莪芪抗瘤方剂诱导白血病hl》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、莪芪抗瘤方剂诱导白血病HL.freel)oncutemyelocyticleukemiaHL-60cell,pharmacology,HL-60cellsfor24,48,72and96hoursrespectively.Cellsicroscope.SubG1DNAinedbyfloeter.IntracellularCa2+concentrationeasuredbyfura-2fluorescenceloadmethod.Caspase-3enzymaticactivityeasuredbycolorimetry.Bcl-2genee
2、xpressioneasuredbyLSAB.ResultsThecontained-herbserumcouldinduceapoptosisofHL-60cells.IntracellularCa2+concentrationoftreatmentententpharmacology,EqipoundprescriptioncouldinducedapoptosisofacutemyelocyticleukemiaHL-60cell,yelocyticleukemia；apoptosis；Caspase-3；Bcl-2越来越多的研究表明
3、,细胞内Ca2+水平升高与诱发细胞凋亡密切相关1。细胞内凋亡相关基因Caspase-3活性变化对凋亡的诱导起重要促进作用2。Bcl-2是重要的抑凋亡基因之一,过度表达Bcl-2的急性白血病细胞抑制凋亡3。本实验主要观察莪芪抗瘤方剂(含药血清)对白血病HL-60细胞内Ca2+浓度、促凋亡基因Caspase-3活性及抑凋亡基因Bcl-2表达的影响,探讨其可能的作用机制。1材料与方法1.1动物日本大耳白兔,雄性,体重2.5～3kg,兰州医学院实验动物室提供。1.2药物莪芪抗瘤方剂由莪术、三棱、黄芪、女贞子等药物组成,甘肃省药材公司饮片厂提供,按工
4、艺制成每1mL含原药材5g的浸膏,4℃保存备用。1.3含药血清的制备以纯种雄性日本大耳白兔10只,每日给予含莪芪抗瘤方剂浸膏10g/kg灌胃,另设3只为对照组(生理盐水组)。连续10d,于最后一次灌药后1h(灌药前禁食、不禁水12h),心脏采血并分离血清,经56℃、30min灭活,无菌过滤后,置-20℃冰箱保存备用。1.4细胞培养HL-60细胞由兰州医学院血液病研究所传代保存,采用常规培养。培养液为含10%的小牛血清,青、链霉素各100U/mL的RPMI-1640,在37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养,每2～3d换液传代培养。1.5细胞
5、形态学观察参照文献4方法略加改动,将细胞以1×104接种于96空板中,24h细胞贴壁后,弃上清。加入10%的含药血清培养基处理细胞,另设未加药对照组。每12h收集对照及药物处理组细胞,离心涂片,用无水乙醇固定10min后,加1.2μg/mL吖啶橙染色30min,于荧光显微镜下观察细胞染色质及RNA变化并拍照。1.6流式细胞术分析参照文献5略加改动,离心收集1×105个细胞,将细胞悬于200μL冷PBS中,冰冻的体积分数为70%的乙醇2mL于4℃固定24h,离心收集细胞,重悬于500μLPBS,另加入RNA酶(100mg/mL),0.1%Tr
6、itonX-100缓冲液,37℃孵育30min,4℃,50mg/mL碘化丙锭染色30min,流式细胞仪(EPICSXL；Coulter,USA)检测DNA含量。1.7细胞内Ca2+浓度测定参照文献6方法进行。用100mL培养瓶,接种5×105个细胞/瓶,药物处理24h后,每12h收集对照及药物处理组细胞,用胰蛋白酶消化,两瓶细胞收集成一组,每组调整细胞浓度1.5×106个细胞/mL,用含0.2牛血清白蛋白(BSA)的RPMI-1640培养液3mL制成细胞悬液。设定发射波长500nm,光栅10nm,在37℃下用激发波长为340nm和380nm
7、测定自发荧光；加Fura-2/AM(终浓度为1.67μg/mL)5μL,37℃恒温振荡45min；加Fura-2/AM扩散入细胞膜后其脂溶性基团AM被酯解,释放出Fura-2,Fura-2最大激发波长为380nm,而与细胞内游离Ca2+结合后最大激发波长移至340nm,离心,去上清,用HBSS-BSA缓冲液洗涤2次,加3mLHBSS-BSA缓冲液制成细胞悬液,用上述2个激发波长测定负载Fura-2的荧光强度；然后加TritonX-10015μL裂解细胞,测这2个激发波长的最大荧光强度,最后加0.1mol/LEGTA(pH8.7)500μL络
8、合Ca2+测这2个激发波长的最小荧光强度。根据文献6制定的公式计算细胞内Ca2+浓度。1.8Caspase-3活性检测分别收集诱导组、未诱导组2×106个细胞,1000r/min
