l-asp诱导急性髓细胞白血病细胞株hl-60凋亡

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1、L-Asp诱导急性髓细胞白血病细胞株HL-60凋亡研究生：刘元军导师：李晓明教授摘要自从1967年Oetten等首次发现左旋门冬酰胺酶（L-Asparaginase，[1]L-Asp）的抗肿瘤作用以来，它已被广泛应用于临床上许多肿瘤疾病的治疗，并且显著提高了患者的完全缓解率（CR）和长期无病生存率（DFS）。左旋门冬酰胺酶（L-Asparaginase，L-Asp）是临床上治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的主要药物，尤其对儿童患者疗效显著。以前研究者们普遍认为L-Asp抗肿瘤药理机制是：L-Asp能特异性催化门冬酰胺（Asn）分解

2、成氨和门冬氨酸（Aspa）从而耗竭血浆中Asn。由于正常细胞内部存在充足门冬酰胺合成酶（Asparaginasesynthetase，AsnS）及活性，能够催化门冬氨酸再合成门冬酰胺，从而保证了正常细胞内的蛋白生物合成不受影响。但在肿瘤细胞中，特别是急性淋巴细胞白血病细胞和非霍奇金淋巴瘤细胞，这些肿瘤细胞内的AsnS表达量和活性都远远低于正常细胞，所以不能为肿瘤细胞合成足够的Asn,而必须依赖细胞外Asn的供应，当细胞外Asn被L-Asp耗竭后，肿瘤细胞蛋白生物合成严重受阻，导致其DNA和RNA合成严重受抑制，最终导致细胞功能受损，肿瘤细胞死亡，此为L-A

3、sp抗肿瘤公认的原理。但是临床治疗中1发现不同类型疾病以及相同疾病的不同患者对L-Asp敏感性和疗效都不尽相同，而且这些患者血液中的Asn都已被耗竭。这提示细胞对L-Asp的敏感性存在于细胞内部对这种氨基酸耗竭的反应性不尽相同，从而表明不能将血浆中Asn是否已被完全耗竭作为L-Asp是否发挥作用的标准。以往临床上主要是将L-Asp用于治疗ALL和NHL，一般不用于治疗髄系白血病。但是最近国内外研究表明用甲基硫氮二烯五环四唑分析法（MTT法）体外测定L-Asp对急性髄系白血病（AML）FAB分型（French-American-Britishsubtypeo

4、facutemyeloidleukemia）中M4,M5型细胞的毒性等同于对ALL细胞的毒[2]性,并且此现象可用于预测临床上用L-Asp初始化疗的疗效反应。其中M5型AML对临床常规化疗药物的疗效差，预后不良，死亡率高，以上研究提示L-Asp治疗M5型AML具有独有的优势。国外还有将L-Asp联合其他化疗药物对AML患者进行化疗，或者联合异基因造血干细胞移植治疗AML患者，并取得良好疗效的报道。这些研究结果提示L-Asp具有临床治疗AML的潜在应用价值，其作用机制还没有完全阐明。L-Asp诱导AML细胞株HL-60细胞凋亡的研究国内尚无报到，要进一步了解

5、L-Asp的治疗潜能开展本课题研究是有必要的，以下为本课题研究内容。目的：为进一步了解L-Asp临床治疗潜能和其作用机制以及开发更有效的药物治疗AML打下实验基础。方法：众所周知，L-Asp治疗ALL的疗效是肯定的，本研究以ALL细胞株Jurkat作为阳性对照，按照MTT法原理用细胞计数Kit-8试剂盒（CellCountingKit-8,CCK-8试剂盒）测量经L-Asp处理后两种细2胞株的细胞生长抑制情况和半数抑制浓度（IC50），再做对比确定差异的统计学意义；用Annexin-V-FITC/PI试剂盒，罗丹明123（Rh23）检测磷脂酰丝氨酸外翻（p

6、hosphatidylserjine,PS）和线粒体跨膜电位（Mitochondrialtransmembranepotential,ΔΨm）这些细胞凋亡早期的特有变化，以及用Hoechst33258荧光染料观察细胞凋亡形态，两细胞株间比较确定统计学差异。结果：L-Asp对HL-60有明显的生长抑制作用；HL-60细胞24h和48h的IC50分别为5U/ml和2.1U/ml；Jurkat细胞24h和48h的IC50分别是4.5U/ml和1.7U/ml,两细胞各时间点的IC50值比较用t检验p值均小于0.05，差异无统计学意义；经本研究凋亡指标检测证实L-A

7、sp能诱导HL-60细胞凋亡。结论：L-Asp对HL-60细胞有明显的生长抑制和凋亡作用，且此作用与其对Jurkat细胞的凋亡诱导和生长抑制作用相同；L-Asp具有临床治疗AML的潜能。关键词：L-Asp；HL-60；急性髄系白血病；凋亡3L-AspinduceacutemyelocyticleukemiacelllineHL-60toapoptosisGraduateStudent:YunjunLiuAdvisor:Prof.:XiaomingLiAbstract:Since1967whentheenzyme-Lasparaginase(L-Asp),w

8、asdemonstratedtohaveefficienceofa