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1、红芪总黄酮对人白血病细胞诱导分化的影响【关键词】红芪；黄酮化合物；HL-60细胞；C-fos基因红芪为豆科植物多序岩黄芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz)的干燥根,是黄芪中的上品,具有补气固表、利尿排毒、排脓、敛疮生肌等多种功效。黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分,广泛存在于蔬菜、水果和药用植物中,是目前人们比较关注的一类化合物。该类成分对白血病细胞生长、分化、凋亡等方面的影响及其机制的研究也已成为目前的热点之一。本实验对红芪总黄酮诱导白血病细胞分化的作用进行了研究并初步探讨其作用机制,为红芪总黄酮的开发利用提供实验依据。 1实验材料 红芪为甘肃陇西产道地
2、药材,经我院中药鉴定教研室张西玲教授鉴定为正品,其总黄酮由本研究室分离和纯化,含量经测定为88.3%。RPMI1640为美国Sigma公司产品。新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。CD11b-FITC荧光标记单克隆抗体；兔抗人C-fos多抗、羊抗兔FITC-IgG二抗购自美国SantaCruz公司。其他均为市售分析纯试剂。 2实验方法 2.1细胞培养 HL-60细胞由本院科研中心细胞生物研究室传代保存。常规培养,培养液为含10%的小牛血清,青、链霉素各100U/mL的RPMI1640,在37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养,每2～3d换液传代培养,选取对数生长期细胞用于实验
3、。 2.2细胞功能学分化检测 采用NBT还原实验,药物处理48h后,细胞悬液中加入等量NBT反应液(0.2%NBT,TPA600μg/L),37℃保温1h,离心弃上清,制细胞涂片,计数至少200个细胞,计算NBT阳性细胞百分率。 2.3细胞表面标记检测 参照文献[1]方法,取药物处理48h的HL-60细胞,PBS洗2次,调节细胞浓度为每升1.0×109个,取100μL,加入CD11b-FITC单抗10μL,混匀后避光孵育30min,再用含0.5%小牛血清的PBS洗2次,于流式细胞仪(美国Becman-Coulter公司)上分析FITC(对数值)对细胞数的直方图,并得出阳性表达率。
4、 2.4细胞周期分析 收集4mg/L红芪总黄酮处理48h的细胞,调节细胞浓度为1.0×109/L,流式细胞仪检测,采用美国VeritySoftL固定,-20℃保持12h以上。用前离心去除固定液,PBS洗两次,调节细胞浓度为1.5×109个/L。各取此细胞悬液200μL,1∶200稀释的兔抗人C-fos多抗200μL,37℃孵育30min,PBS洗2次,弃上清液,再加入1∶100稀释的羊抗兔FITC-IgG二抗150μL,37℃避光孵育30min,PBS洗2次,流式细胞仪上分析FITC(对数值)对细胞数的直方图,并得出阳性表达率。 2.6统计学方法 以上每组实验及检测均重复3次以上,实
5、验结果用x±s表示,用SPSS11.0软件进行t检验分析。 3结果 3.1细胞功能检测NBT还原测定表明,HL-60细胞经60、80、100mg/L红芪总黄酮处理48h后,NBT阳性率分别为(31.2±2.6)%、(48.7±3.7)%、(61.8±5.6)%,较未加药组(13.1±1.1)%明显升高(P<0.01)。 结果显示,用60～100mg/L红芪总黄酮处理48h,HL-60细胞周期阻滞于G0/G1、G2/M期,并有一定的浓度依赖关系。相应S期细胞减少。但促进细胞凋亡的作用不明显(见表1)。表1红芪总黄酮对HL-60细胞周期及凋亡率的影响(略)注：与对照组比较,△P&l
6、t;0.05,△△P<0.01 3.4分化相关基因检测 (见表2)表2红芪总黄酮对HL-60细胞C-fos表达的影响(略)注：与对照组比较,△△P<0.01 4讨论近年来,中药以其有效、低毒的优势作为治疗肿瘤的疗法日益受到人们的重视,一些草药及自然产物正被应用于肿瘤治疗的临床实验中[3-4]。已有的实验结果表明,一些草药及其成分具有直接抑制肿瘤细胞增殖的药理作用[5]。因此,从中草药中寻找低毒、有效的抗癌成分已成为研究人员格外重视的领域。本研究结果显示,HL-60细胞经红芪总黄酮处理后,NBT还原能力明显增强,CD11b表达升高,提示早幼粒细胞通过红芪总黄酮诱导分化作用逐
7、渐获得了成熟粒细胞表面标志及功能。红芪总黄酮作用后,HL-60细胞被阻滞于G0/G1期、G2/M期,S期细胞明显减少,从而导致细胞增殖减慢,趋向分化。 细胞增殖与分化受到增殖分化相关基因的调控。C-fos原癌基因编码分子量为55KD,含380个氨基酸残基的蛋白质Fos。C-fos是对某些生长因子和分化诱导剂刺激反应最早的早期应答基因(earlyresponsegene)之一,其基因产物与诱导分化有关,在成熟的粒细胞和单
