低氧诱导因子过表达对人外周血内皮祖细胞分化影响的体外研究

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1、低氧诱导因子过表达对人外周血内皮祖细胞分化影响的体外研究作者：姜萌，王长谦，王彬尧，何奔，邵琴，黄定九【摘要】为了研究低氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor-1alpha，HIF-1α)在体外对人外周血内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPC)向血管内皮细胞(endothelialcells，EC)分化的影响，用密度梯度离心法分离人外周血EPC，电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPC，计算转染效率，RT-PCR方法测定HIF-1α、HIF-1β及HIF-1α下游靶基因血

2、管内皮生长因子(vascularendothelialgroRNA在质粒转染前后含量变化，免疫细胞化学方法检测在常氧下HIF-1α蛋白在HIF-1α质粒转染前后不同时点蛋白表达情况，细胞膜表面抗原决定簇流式细胞术测定FITC-CD31+EPCs/EC在未转染组、pEGFP空质粒或HIF-1α质粒转染组转染3-10天后的组间差异，光镜下观察转染前后细胞形态及分化程度。结果表明：EPC获得后经电穿孔转染，质粒转染效率约20%；RT-PCR示HIF-1αmRNA在常氧中有表达，并在HIF-1α过表达组含量增加（P<0.0

3、5）；其下游靶基因VEGF在HIF-1α过表达组表达上调（P<0.05）；HIF-1β表达在各组中无明显差异（P>0.05）。免疫组织化学显示常氧下HIF-1α蛋白无表达，转染HIF-1α质粒12小时后HIF-1α蛋白表达阳性，转染24小时后蛋白表达阴性。流式细胞仪检测显示电穿孔转染HIF-1α质粒使CD31+细胞的百分比增加（P<0.05）。细胞形态学观察显示：未转染及pEGFP空质粒转染组细胞在培养6天后呈集落样散在分布，培养14天后贴壁细胞部分呈梭样；穿孔转染的HIF-1α质粒组细胞于培养6天后集

4、落周边分化出梭样贴壁细胞，培养14天后呈梭样，或铺路石样牢固贴壁。结论：HIF-1α质粒能有效地用于基因干扰治疗，有助于EPC向EC分化，为体内研究奠定了基础，也为进一步体内诱导血管新生、治疗缺血性心脏病提供了更广阔的治疗选择。【关键词】低氧诱导因子-1α　　OverexpressionofHypoxiaInducibleFactor-1alpha(HIF-1α)PromotestheDifferentiationofEndothelialProgenitorCellExVivo　　AbstractToinvestiga

5、tetheinfluenceofHIF-1αoverexpressiononthedifferentiationofendothelialprogenitorcells(EPCs)exvivo，EPCshumanperipheralbloodbydensitygradientcentrifugation，overexpressedHIF-1αRNAleveleasuredmunohistochemistryinatimecourse.CD31+cellseasuredetry.Cellmorphologyarkedlyi

6、nducedbyHIF-1αvector(P<0.05).HIF1βhaditssamelevelasitbeforeinterference(P>0.05).HIF-1αprotEInentsrevealedthatCD31+EPCs/ECcouldbegeneratedmoreefficientlyfromoverexpressedHIF-1αthanthatfrompEGFPtransfectedgroup(P>0.05).EPCmorphologyicroscopy.HIF-1α-transfe

7、ctedcellsundernormoxiasproutedmorerapidlyfromtheEPCcoloniesthantheuntransfectedcellsorcellstransfectedaintainedtheoriginalcolonyformation.HIF-1αtransfectedcellstookonanarray-likearrangementratherthanrandomdispersal，suggestingthattheyictreatemtninvivo.　　KeyershamB

8、ioscience公司；60mm细胞培养皿（Falcon公司产品)；M199培养基(Gibco公司产品)；VEGF生长因子终浓度10ng/ml、bFGF生长因子终浓度2ng/ml(CytoLab/PeprotechAsia产品)，0.22μm微孔滤膜抽滤后，-20℃保存备用；20%胎牛血清(鼎国生物公司产品)；人外周