通心络体外促进人外周血内皮祖细胞的增殖、迁移、黏附的研究

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1、l材料与方法l·l主要试剂和材料通心络超微粉由石家庄以岭药业股份有限公司提供；淋巴细胞分层液、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、nTC标记荆豆凝集素I(踟’C．uEA．I)均购自美国Si舯a公司；Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Di-laeLDlL)购自M龇ularProbe公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；血液样本采自6名健康成人志愿者，每份50llll。l·2通心络超微粉溶液的制备用达尔伯克必需基本培养基(DMEM)溶解通心络超微粉，配置成10mg／nll原始液

2、，室温条件下，充分震荡10试n，超声溶解1min，以1000g离心20min后，除去沉淀物，保留上清用于细胞培养。l·3细胞培养与鉴定取健康成人外周血50nll，用密度梯度离心法分离出单个核细胞。以5×lOs／cm2密度接种于预先包被人纤连蛋白的6孔板培养皿中，每皿加入3Hd培养液M199(含20％胎牛血清、青霉素100U／llll、链霉素100U／llll、VEGF10ng／nd、bFGF2n∥m1)。置于37℃5％C02饱和湿度培养箱中培养。4d后用PBS液洗掉非贴壁细胞。7d后将细胞以O．25％胰酶消

3、化，制成1×106／lIll的单个核细胞悬液，细胞与2．4嵋／llllDi·lacLDL37℃孵育lh，以检测EPCs对Di．1acLDL的摄取。然后用2％多聚甲醛固定纽胞10min。固定后用PBS浸洗，将FITC—UEA-I(10pg／lnl)加入上述标本中，在37℃下孵育lh。通过激光共聚焦显微镜鉴定FrrC-UEA-I和DiLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。同上细胞悬液中加入FTI'C荧光标记的小鼠抗人的CD34抗体、CDl33抗体及同型对照10出(1mg／m1)，流式细胞仪分析细胞CD34、

4、CDl33的表达。1．4实验分组及细胞处理取培养7d的EPc8用于研究，细胞同步化后，设对照组，分别观察不同水平通心络(50、100、200、500、750和1000仙g／n11)孵育36h后，体外培养的EPCs形态学的改变及其增殖、迁移、黏附能力的变化。观察500ug／

5、lll通心络不同孵育时间(O、6、12、24和36h)对体外培养的EPCs形态学及增殖、迁移、黏附能力的影响。1．4．1EPCs形态学观察：普通倒置显微镜下观察各组不同时期细胞的生长特点及形态。1．4．2册T法测定EPCs增殖能力：将不同

6、处理组处理后的EPC8，用0．25％胰蛋白酶消化后，制备成细胞悬液。再按每孔100一接种于96孔培养板，每组设6个复孔和空白对照，每孔加20一MTT试剂(5mg／lnl)培养4h后，弃上清，再加入二甲基亚砜每孔100一。于微量振荡器充分振荡5nlin，使结晶物充分溶解，在波长为490咖时测定各孔光密度(D)值。EPCs增殖率=(实验组D值一对照组D值)／对照组D值×100％。1．4．3Tr锄sweⅡ小室测定EPCs迁移能力：用0．25％胰蛋白酶消化后，收集以上不同处理后的贴壁EPC8，烈黧驾案慧。恭篓警盒款

7、型善i慧糍f裂燃嚣篇等善：养液．将lx105EPcs细胞悬液100斗l加入上室，在37℃5％c02饱和龊度堵赛籀甲孵臂鹚ho职出咖‘sweU小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，将已经侵人并贴附于微孔膜下层的细胞固定于4％多聚甲醛中lOmin，0．25％结晶紫染色。随机计数6个视野(×200)，评价EPC8的迁移能力。1．4．4细胞记数法测定EPcs黏附能力同上搜集不同处理组的贴壁EPCs，悬浮于500一培养液中，计数，然后将同等数目的EPCs接种在包被有人纤维连接蛋白培养板，在37℃5％CO：饱和

8、湿度培养箱中培养30lllin，计数贴壁细胞。各组实验数据重复测量5次。1．5统计学处理计量资料用(元±s)表示，采用sPsSll．o软件做多样本均数间比较的方差分析，以P

9、棱蛔胞培彝第2*围2单十榷细胞培彝筹4*囤3单个桉细胞培养第7天2Epc8的鉴定用Di—lacu儿和ⅡTc-uEA4对细胞染色后，通过激光共聚焦显徽镜鉴定，显示红色荧光的细胞为摄取们LDL阳性，显示绿色荧光的细胞为摄取uEA—I阳性，双染色阳性细胞(橙黄色)为正在分化的EI℃s(见囤4)。流式细胞仪示贴壁细胞表达cD34阳性率为697％±65％，cDl33阳性率为804％±83％．“m口蚰ⅡE，*￡**BgmuE