低氧诱导因子-1对肝细胞生长因子基因表达调控机制的研究

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1、中国医学科学院中国协和医科大学博士学位沦文中文摘要低氧诱导因子一1对肝细胞生长因子基因表达调控机制的研究目的：第一部分：(1)观察氯化钴(CoCl2)及HIF．1a过表达对乳鼠心肌细胞及人宫颈癌Hela细胞存活及凋亡状况的影响。(2)观察CoCl2模拟的低氧以及由peDNA3一HIF—let真核表达质粒转染介导的HIF．1ct过表达对乳鼠心肌细胞和Hela细胞中HGF／c-Met系统mRNA和蛋白表达的调节。(3)对人HGF基因启动子区进行生物信息学分析，寻找可能介导HGF低氧表达调控的转录因子作用位点。第二部分：根据

2、生物信息学分析结果，在Hela和转染效率较高HEK293细胞中，研究HIF．1a对TGF．B2基因表达调控的作用机制，并进一步观察重组转化生长因子．B2(transforminggrowthfactor-132，TGF一132)对Hela细胞中HGF表达的影响，方法：第一部分：(1)体外培养乳鼠原代心肌细胞和Hela细胞，应用MTT和流式细胞仪检测CoCl2对乳鼠心肌细胞和Hela细胞存活、增殖及凋亡的影响。(2)构建pcDNA3一HIF．1et真核表达质粒(3)免疫印迹检测CoCl2和pcDNA3一HIF—la质粒转

3、染诱导的HIF．1et过表达后，Hela细胞中凋亡相关蛋白Bcl．2和Bax的表达。(4)RT-PCR检测1001maol／LCOCl2作用6～72h后，心肌细胞中HGFmRNA的表达。(5)WesternBlot检测1001xmol／LCoCl2作用心肌细胞12h后HIF．1a蛋白的表达。(6)相对荧光实时定量PCR检测COCl2和pcDNA3．HIF．1et质粒转染后，Itela细胞中HGF／c—MetmRNA的表达。(7)ELISA检测COCl2对Hela细胞中分泌性HGF蛋白表达的影响。(8)利用生物信息学分析

4、人HGF基因启动子区可能的转录因子结合位点。第二部分：(1)构建pGL3。EPO．HRE荧光素酶报告质粒和pGL3．TGF．B2及其五个突变体的荧光素酶报告质粒。(2)WesternBlot和双荧光素酶报告基因法检测CoCl2和peDNA3．HIF．1et质粒转染后，Hela和HEK293细胞中HIF．1et蛋白的表达量及其DNA结合活性。(3)相对荧光实时定量PCR检测250p．mol／LCoCl2单独作用Hela和HEK293细胞6h后，TOF—B2mRNA的表达，以及CoCl2处理和peDNA3．HIF．1et质

5、!垦垦兰登兰堕!璺堡塑垦登奎兰堡主兰垡笙苎粒转染后，Hela细胞中TGF．B2mRNA的表达。(4)双荧光素酶报告基因检测COCl2和pcDNA3．HIF—la质粒转染对TGF．02启动子区报告基因及其相应突变载体报告基因活性的影响。(5)在HEK293细胞中进行CHIP实验，证实HIF-la在TGF—p2基因启动子区的结合位点。(6)ELISA法检测重组TGF—B2作用Hela细胞后，HGF蛋白的表达量。结果：第一部分：(1)测序结果表明，pcDNA3．H1F．1a表达质粒构建成功，可以用于下一步的实验。(2)50～

6、250Hmol／LCoCh作用12h后，心肌细胞的存活率明显降低；与之相反，O～150pmol／LCoCl2不会改变Hela细胞的增殖活性，加大浓度后会明显减少活细胞数量；250～5001amol／L范围内的CoCl2可以引起Hela细胞的少量凋亡；Hela细胞中，HIF一1c‘过表达引起的凋亡和凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax比值降低有关。(3)乳鼠心肌细胞中，CoCh可以诱导HIF．1a表达，并降低HGFmRNA的表达水平。(4)Hela细胞中CoCl2和pcDNA3-HIF．】n质粒转染可以显著降低HGFmRNA的

7、表达，却增加其受体c—MetmRNA的表达。(5)ELISA结果显示，CoCl2作用Hela细胞6h后，HGF分泌蛋白的水平明显呈浓度依赖性增高，而在其它时间点，HGF并没有明显升高。(6)生物信息学分析显示HGF启动子区可能受到TGF．132的调节。第二部分：(1)野生型TGF．p2启动子区报告基因及其相应5个HRE突变报告载体以及pGL3．EPO，HRE报告基因构建成功。(2)CoCh处理和pcDNA3．H1F—lG质粒转染Hela和HEK293细胞后，HIF．1“蛋白表达均增加。但是，HIF．1a过表达后，其DN

8、A结合能力在HEK293细胞中大约增高250倍，而在Hela细胞中只增加4．5倍左右。(3)250肚mol／LC002作用6h后，HEK293细胞中TGF一132mRNA水平轻度增高约1．4倍，但Hela细胞中却降低大约3倍。进一步用CoCl2和pcDNA3．HIF．1a质粒转染处理Hela细胞，发现TGF—B2mRNA水平显著下