外治法对实验性兔膝骨性关节炎滑膜中bfgf表达的

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1、外治法对实验性兔膝骨性关节炎滑膜中bFGF表达的摘要：目的：了解外治法对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在实验性兔膝骨性关节炎滑膜中的表达分布情况的影响，探讨中医外治法治疗骨性关节炎的机理。方法：32只实验动物随机分为正常组、模型组、扶他林组和外治法组，采用股静脉结扎方法造模成功后，治疗1个月。用免疫组化SABC方法对实验动物膝关节滑膜bFGF的表达分布进行观察。结果：造模组24只动物膝关节滑膜中bFGF免疫组化阳性率为92%（22/24），且外治法组表达强于扶他林组和模型组。正常组8只动物的膝关节滑膜中免疫组化为阴性。结论：外治法能够促进实验动物膝关节滑膜bFGF

2、的表达，从而为外治法治疗骨性关节炎在细胞因子水平提供理论依据。　　关键词：骨性关节炎；外治法；碱性成纤维细胞生长因子；滑膜　　骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种慢性关节病，又称退行性关节病、增生性关节病等。其特征是关节软骨发生原发性或继发性退行性变，并在关节边缘有骨赘形成。本病的病理变化以关节软骨变性及软骨下骨质病变为主。中医外治法治疗OA有显著疗效[1-2]。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能够诱导外胚层和中胚层的细胞增殖和分化，具有强大的促有丝分裂的作用，且在软骨损伤后的修复中有很重要的作用。本实验通过检测bFGF在兔关节滑膜中的表达及分布，

3、试图探讨中医外治法治疗OA的机理。　　1材料　　1.1实验动物　　健康雄性新西兰大耳白兔32只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，质量2.1～2.5kg。　　1.2实验试剂及仪器　　bFGF一抗、SABC试剂盒、DAB显色盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；扶他林乳胶剂购自湖北省中医医院。熏洗中药购自湖北武汉定康大药房，方剂采用湖北省中医医院成方伤科熏洗汤。中药组成：羌活12g、独活12g、桂枝10g、桑枝30g、伸筋草10g、透骨草10g、花椒10g、艾叶10g、五加皮12g、海桐皮12g、白芷10g、防风10g。G6805-1型针灸治疗仪为青岛鑫升实业有限公

4、司生产，湖北中医学院针灸实验中心提供。　　2方法　　2.1造模方法　　以结扎股静脉的方法[3]造模，用0.3%的戊巴比妥按3mg/kg剂量进行耳缘静脉麻醉。麻醉满意后将家兔仰卧固定于兔台上，四肢伸直。所有实验动物均取右侧下肢造模。右侧股根部备皮、消毒，无菌条件下操作，用手指触及腹股沟股动脉搏动处并以此为中心，做2cm纵行切口，切开皮肤、皮下组织，暴露股神经血管束，分离股静脉并进行双重结扎，在两道结扎线间将股静脉剪断，缝合皮肤及皮下组织。术后每天肌注青霉素20万U/只，共7d，以预防感染。　　2.2分组及处理　　32只白兔随机分为正常组、模型组、扶他林组和外治法组，每组

5、8只。正常组不做任何特殊处理。模型组造模成功后正常喂养，自由活动。扶他林组用扶他林乳胶剂在患膝周围涂抹均匀，轻揉3~5min。外治法组则用中药熏蒸配合手法弹拨以及电刺激，每次熏蒸30min，手法弹拨20min，以膝关节周围及股后侧及小腿后侧肌肉为主，配合伸膝关节。电刺激采用G6805-1型针灸治疗仪，配用自制电极，主要刺激兔股前侧及小腿后侧肌肉及膝周穴位，引起兔患膝被动屈伸达40°～50°为宜，主要以屈曲为主。以上两组均造模成功、自由喂养8周后分别开始治疗。治疗4周后处死动物取标本，标本取出后用10%多聚甲醛固定，行石蜡切片。模型组和正常组均在相应时间处死，取标本做石

6、蜡切片。　　2.3检测方法　　石蜡切片常规脱蜡，3%的双氧水室温5～10min灭活内源性酶。抗原热修复。滴加5%BSA封闭液，20min(室温下)。加入稀释的bFGF一抗，1h(37℃)。加入生物素标记的羊抗兔二抗，链霉亲合素生物素过氧化酶溶液与DAB液，室温显色，镜下控制反应时间。苏木素复染封片观察。其间每个步骤均用PBS冲洗5min3次。结果判定：在400倍高倍镜下观察细胞内外有无染色，未着色为阴性，浅棕黄色为弱阳性，中等棕黄色为阳性，深棕黄色为强阳性。　　2.4统计方法　　实验数据以平均值±标准差(±ｓ)表示，组间差异比较采用q检验，所有数据均采用SPSS11.

7、0统计软件进行分析。　　3结果　　正常组免疫组化染色为阴性；模型组仅有部分细胞因子反应阳性，部分为弱阳性，胞浆中有黄褐色的斑块状阳性物质分布，但量较少，大部分细胞无着色，外治法组和扶他林组与正常组相比有所不同，胞浆中阳性物质数量增多，阳性细胞增加。在400倍光镜下每组选取10个典型视野，采用同济医科大学免疫组化实验室HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系统进行分析。具体结果见表1。　　表1各组bFGF平均光度均值的比较(略)　　注:与外治法组比较*P＜0.05，**P＜0.01　　4讨论　　bFGF最早由牛的脑垂体中提取，是由146个氨基酸组