elisa检测p24抗原用于诊断hiv感染的研究

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1、ELISA检测p24抗原用于诊断HIV感染的研究［关键词］ELISA；p24；HIV　　1HIV感染实验诊断的研究概况　　HIV主要通过性接触、血液和母婴传播。近年来，欠发达国家的感染人数超过发达国家。预计到2010年我国感染HIV的人数将超过1000万。目前测定血清HIV抗体是诊断HIV感染的常规实验方法，但是测定HIV抗体有局限性：有超过70%的HIV感染者在感染6个月后才能检测出抗体，在同性恋群体，这个数字超过80%，检测技术增加了HIV“窗口期”传播的危险［1］；新生儿产生抗体需要出生1年后，来自母亲的HIV抗体会致使假阳性产生；HIV抗

2、体持续存在，艾滋病晚期时消失，无法作为治疗监测的稳定指标。　　2p24的和实验价值　　24kDa的蛋白质p24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之间高度保守，缺失p24会导致病毒无法正常组装。衣壳蛋白p24特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，可以用于HIV感染的早期诊断，抗HIV药物疗效的检测及HIV感染者发展为艾滋病的动态观察。HIV1感染机体后,感染者血液中最早出现的是病毒gag基因表达产物p24抗原,然后才出现相应的特异性抗HIV抗体,以后随抗体滴度的升高p24

3、抗原含量呈逐渐下降的趋势,以至检测不出。在病情发展后期,病毒大量复制,机体免疫力下降,所产生的抗体不足以中和病毒抗原时,p24抗原在血中又可测出。HIV阳性母亲所生育的婴儿30%可能已受到感染,但由于婴儿体内母源性抗HIV抗体可持续13个月～21个月之久,常规检测抗HIV抗体不适用于婴儿,而p24抗原的检测则可弥补这一不足。　　3p24抗原用于HIV感染的诊断　　HIV1和HIV2的p24抗原不同，但有轻微的交叉反应。因HIV2主要局限于西部非洲，目前p24抗原的研究主要针对HIV1感染。SchüpbachJ比较245份HIV1感染成人

4、不同阶段的血样，发现血浆中p24抗原浓度高于血清［2］，因此建议检测血浆中p24抗原。p24抗原测定主要存在的问题：机体产生针对p24的抗体，抗原抗体结合形成免疫复合物。感染初期，随着抗体大量产生，免疫复合物形成，游离p24抗原减少，致使ELISA测定p24抗原得出假阴性结果。为提高p24检测HIV感染的敏感度，在检测之前需要将抗原抗体复合物分开。将抗原从免疫复合物上分开主要通过加热和酸碱中和。酶标记抗原斑点试验（EnzymeLabelledAntigenSpotTest,ELAST）能显著提高ELISA实验的敏感度和特异度。　　3.1实验步骤患

5、者血浆用0.5%三硝基甲苯稀释至1∶6比例后100℃加热5min。已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照同时操作。所有标本（100μl/份）加入微孔中37℃孵育60min后，用稀释的磷酸盐缓冲液（PBS）洗板后，加入100μl用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗p24抗体，再37℃孵育60min。洗板后，来自ELASTELISA系统的100μl生物素酪胺加入微孔中，室温下孵育60min。再次洗板后，来自ELASTELISA系统的链霉素辣

6、根过氧化物酶用1%小牛血清PBS吐温20ml溶液稀释至1∶500，取100μl加入每个孔中，室温下孵育30min后洗板。100μl四甲基联苯胺底物加入微孔中，室温下孵育30min。然后加入100μl1mol/L的硫酸终止显色反应。15min内450nm测定吸光度，当吸光度＞0.12时被认为是阳性［3］。　　3.2敏感度和特异度SutthentR等发现采取ELASTELISA方法测定血浆p24的线性范围是0.5pg/ml～80pg/ml。针对新生儿感染HIV的检测，p24检测的敏感度(100%)与HIV1RNA检测的敏感度相同，高于检测HIV

7、1DNA（61.9%），三种方法的特异度都可达100%［3］。SchupbachJ等研究390例HIV感染母亲生产的婴儿，发现经过中和抗体，p24检测的特异度可达100%，在125例感染HIV的儿童中，p24检测敏感度可达97%高于PCR检测HIVDNA（96%）和病毒培养结果（77%）。普通采用免疫复合物分离技术测定p24抗原的方法敏感度低，而且只能检出50%没有症状的HIV患者。如今已有商品化试剂盒（bioMerieux）采用ELASTELISA方法检测p24抗原，其敏感度和特异度能和PCR检测HIV1RNA相媲美。　　4检测p24抗原的

8、方法临床价值评判　　4.1p24抗原用于HIV1的早期诊断成人HIV感染至抗体阳转需要6个月时间［1］。p24抗原在感染早期，病毒大量