人肝癌细胞总rna电转染树突状细胞的体外肿瘤杀伤

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1、人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞的体外肿瘤杀伤【摘要】目的：探讨人肝癌细胞总RNA电转染人树突状细胞(DendriticCells,DCs)后诱导特异性效应T细胞及其效应T细胞抗肝癌的特异性。方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，采用细胞因子体外培养诱导其成为未成熟树突状细胞（ImmatureDendriticCell,imDC）和成熟树突状细胞（MatureDendriticCell,mDC）。培养肝癌细胞，Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA。通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入imDC内；观测电转染的转染率；采用免

2、疫细胞化学检测电转染前后的imDC形态及其表面标志；通过混合淋巴细胞实验，获取mDC激活的特异性效应T细胞。用MTT法测定效应T细胞的抗肝癌特异性。结果：电转染方法可将人肝癌细胞总RNA导入imDC。电转染前后imDC分子表达无显著差异，mDC的分子表达与imDC相比发生了变化。转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞。效应T细胞可特异性的杀伤人肝癌细胞，而对不相关的MG-63细胞无特异性的杀伤作用。结论：电转染不影响imDC的形态和原有的蛋白表达；转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞；

3、效应T细胞具有抗人肝癌细胞的特异性。【关键词】树突状细胞肝癌细胞总RNA转染人AbstractObjective:Toinvestiageandendriticcells(DCs)acellscouldinducethespecificeffectiveTcells,thenanalysisthespecificythateffectiveTcellskilltargethepatocarcinomacells.Methods:Monocytesobtainedformhumanperipheralbloodbydensityguad

4、ientcentrifugationareinducedintoimmatureDCsandmatureDCsinthepresenceofcytokinesinvitro.ThetotalRNAofhepatocarcinomacellsareextractedbyTrizolandareeletransfectedintomonocyte-derivedimmatureDCs.Thesuccessrateofelectransfectionismeasured.I-1640培养液，购自美国GIBCO公司。淋巴细胞分离液（Ficol

5、l，1.077g/mL），购自上海试剂二厂。胎牛血清（FCS），新生牛血清（NCS），购自美国HYClone公司。重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素2（rhIL-2）和重组人白细胞介素4（rhIL-4），购自德国RD公司。尼龙毛（Scrubbednylonfiber）diameter3，318cm，type200，购自FENHC-Ⅱ、鼠抗人CD86、鼠抗人CD83、鼠抗人S-100、鼠抗人AFP、鼠抗人TERT蛋白单克隆抗体，即用型二步法生物素检测试剂盒（PV9000）、FITC标记的第Ⅱ抗体工作

6、液、磷酸缓冲液（PBS，0.01M，pH7.2～7.4）、多聚赖氨酸、DAB、Triton-100均购自北京中山生物技术有限公司。HEPES，购自Sigma公司。TRIZOL试剂盒、绿色荧光蛋白（GFP）mRNA，购自Invitrogen公司。DEPC购自鼎国生物技术公司。1．2方法1.2.1单核细胞、imDC的获得及培养取正常人新鲜外周血200mL，以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMNC），在37℃和5%CO2饱和湿度条件下培养2h，取贴壁细胞即单核细胞，加入RPMI-1640液、10%胎牛血清（FCS）和细胞因子rhGM

7、-CSF(1000U/mL)；rhIL-4(500U/mL)于37℃和5%CO2饱和湿度条件下培养。第7d收获的细胞为imDC。1.2.2肝癌细胞株Bel-7402总RNA的获得：常规方法对肝癌细胞株Bel-7402进行细胞培养。以Trizol一步法对培养的肝癌细胞进行总RNA抽提，-20℃保存。部分用于测定260nm和280nm分光光度值，估计纯度并定量，部分进行RNA电泳观察其18S和28S条带完整性。1.2.3肝癌细胞总RNA电转染imDC并培养为mDC收集诱导7d的imDC，以无血清培养液洗两次，调整细胞浓度为107个细胞/m

8、L。人肝癌细胞总RNA、PBS、GFPmRNA分别以20μg/0.4mL与imDC在电转杯中混合。均在300V、500uS的条件下进行电转染。电转染后静置5min，将细胞移出电转杯，用含20%FCSRPMI-1640培养