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《尤文肉瘤细胞总rna修饰的树突状细胞的体外培养及其鉴定 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、尤文肉瘤细胞总RNA修饰的树突状细胞的体外培养及其鉴定王剑，桑宏勋，王臻，郭征【关键词】树突细胞；肉瘤,EEtheperipheralbloodmononuclearcells(PBMC)ofEarkersofmaturedDCseter(FCM).TotalRNAEorcellRNA.TheexpressionofDCtansfectedeasuredbyRTPCRmethod.RESULTS:SurfacemarkersofDCpulsed32.24%to72.32%.CD83increasedfrom17.39%to30.97%,onocyteCD14decl
2、inedfrom26.37%to10.46%.ThisindicatedthesignificantreinforcementofantigenpresentationofDC.RTPCRshoerspecificallyatthebesttemperatureof54℃.CONCLUSION:DCpulsedorspecificantigenandexpressitscharacteristicsequenceEHCＩ类分子完全匹配后递呈到细胞表面,被相应Ｔ细胞受体(Tcellreceptor,TCR)识别,形成肿瘤抗原多肽MHCTCR复合物,在协同刺激因子的共同
3、作用下,激活特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞,产生免疫反应、清除肿瘤细胞〔1〕.树突状细胞（dendriticcells,DC)是体内最重要的专职抗原递呈细胞〔2〕,可由骨髓干细胞、外周血干细胞及外周血单个核细胞在细胞因子作用下诱导扩增.95%的尤文肉瘤家族具有特异的染色体异位,从而形成的ECSF诱导下分化扩增DC,从患者尤文肉瘤组织中提取肿瘤总RNA加载DC,并对经总RNA加载后的DC进行鉴定，确定经肿瘤RNA加载的DC持续表达相应特异性肿瘤抗原,为DC在尤文肉瘤生物学免疫治疗中的临床应用提供实验依据.1材料和方法1.1材料RPMI1640(美国GIBCO公司,14.1g
4、/包)；胎牛血清（杭州四季青,250mL/瓶）；IL4（美国R＆D公司,lot#AG131091,14.45×105U/5ug/mLstock）；rhGMCSF（海南通用同盟药业有限公司,150ug/支）；Trizol(美国GIBCO公司)；OligodT(美国GIBCO公司)；血细胞分离机(瑞典GAMBRO.BCT)；梯度PCR仪(德国Eppendorff公司)；流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司)；尤文肉瘤瘤体标本由第四军医大学西京医院骨科2005年收治患者自愿提供（已签知情同意书）；PCR引物由北京三博生物技术公司合成正向序列为5＇CCACTAG
5、TTACCCACCCCAAACTG3＇，反向序列为3＇GTGATACAGCTGGCGTTGGCG5＇.1.2方法1.2.1尤文肉瘤细胞总RNA提取手术无菌切除活力好的尤文肉瘤组织，将其平均切成1mm3大小的组织块，研磨后加Trizol2mL消化2h,将消化好的细胞裂解液吸入2mL装的离心管中，加氯仿0.2mL，静止2min，然后进行离心，离心设定为：8160g,4℃,15min,取上清无色水相0.8mL，装入新的2mL装的离心管中，加0.5mL异丙醇，静置10min，然后再次离心，离心设定为：8160g,4℃，10min,观察总RNA为管底的白色沉淀，用DEPC水溶
6、RNA，并测RNA浓度为4μg/μL.1.2.2DC的体外培养利用血细胞分离机（分离管道：去除白细胞装置管路；分离程序：MNC程序）采集尤文肉瘤患者外周血中的单个核细胞.将获得的单核细胞移入6孔培养板内进行贴壁培养，密度为:1×108/孔,培养液为：RPMI1640(10g/LL谷氨酰胺,10g/L非必需氨基酸,10g/L丙酮酸钠,100mL/L胎牛血清)，37℃,50mL/LCO2孵箱贴壁2h,后用PBS洗涤液洗去未贴壁的细胞（大部分为小的淋巴细胞），然后加新鲜培养液：RPMI1640＋IL4(800U/mL)＋GMCSF(800U/mL)，37℃,50mL/LC
7、O2孵箱中继续培养6d，第2日和4日更换新鲜培养液：RPMI1640＋IL4(800U/mL)＋GMCSF(800U/mL).1.2.3总RNA加载DC在DC培养的第5日，在实验组中以10mg/L的比例加入总RNA,放入孵箱中培养过夜.在DC培养的第6日，在对照组中不加入总RNA进行加载.1.2.4DC的成熟诱导预先在两个100mmPetri培养皿中分别接种5×107的单个核细胞，2h后吸弃其中的非黏附细胞,37℃,50mL/LCO2继续培养24h，收集上清即为成熟DC条件培养液(preparationofmonocyteconditionedmedium,MC
