人肝癌细胞总rna电转染树突状细胞对t细胞的激活效应

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1、人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞对T细胞的激活效应作者：单铁英苏安英唐军民【摘要】目的：采用Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA电转染人外周血树突状细胞（DendriticCell,DC），观察其对混合T淋巴细胞的体外激活效应。方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，用细胞因子体外培养诱导其成为DC。Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA。通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入DC内；通过混合淋巴细胞实验，获取DC激活的特异性效应T细胞。用MTT法测定效应T细胞的增殖率。结果：电转染方法可将人肝癌

2、细胞总RNA导入DC；电转染前后DC分子表达无显著差异。转染了人肝癌细胞总RNA的DC可特异的激活T细胞且增殖率明显增强（P<0.05）。结论：电转染为人肝癌细胞总RNA导入DC提供技术上的可行性；转染了人肝癌细胞总RNA的DC可特异激活T细胞。【关键词】树突细胞核糖核酸转染肝肿瘤【ABSTRACT】Objective:ToinvestigatetheactivationeffectinhumanperipheralbloodDendriticCell（DC)electransfectingtotalR

3、NAofhepatocarcinomacellsextractedbyTrizolinvitro.Methods:MonocytesobtainedfromhumanperipheralbloodbydensityguadientcentrifugationacellsonocytederivedDC.EffectiveTcellsixedlymphologyreaction,ininedbytheMTTmethod.Results:Electransfectioncouldsuccessfullymake

4、RNAintoDC.Thereoleculeexpressionaftertheelectransfection.DCacellscouldactivatespecificallyTcellsandProliferationrateakehepatocarcinomatotalRNAintoDC.DCacellscanactivatespecificallyTcells.【KEYHCⅡ、鼠抗人CD86、鼠抗人CD83、鼠抗人S100，即用型二步法生物素检测试剂盒（PV9000）、FITC标记的第II抗体工

5、作液购自北京中山生物技术有限公司。TRIZOL试剂盒、绿色荧光蛋白（GFP）mRNA，购自Invitrogen公司。1．2方法1.2.1单核细胞、未成熟树突状细胞（ImmatureDendriticCell,imDC）的获得及培养取正常人新鲜外周血200mL，以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，在37℃和5%CO2饱和湿度条件下培养2h，取贴壁细胞即单核细胞，加入RPMI1640液、10%胎牛血清（FCS）和细胞因子rhGMCSF1000U/mL；rhIL4500U/mL继续培养。第7d收获的细胞为i

6、mDC。1.2.2肝癌细胞株Bel7402总RNA的获得常规方法对肝癌细胞株Bel7402进行培养。以Trizol一步法抽提肝癌细胞总RNA，-20℃保存。测定260nm和280nm分光光度值，估计其纯度并定量，进行RNA电泳观察其18S和28S条带完整性。2008年10月单铁英等：人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞对T细胞的激活效应第5期2008年10月河北北方学院学报（医学版）第5期1.2.3肝癌细胞总RNA电转染imDC并培养为成熟树突状细胞（MatureDendriticCell,mDC)收集诱导

7、7d的imDC，调整细胞浓度为1×107/mL。分两组：一组为人肝癌细胞总RNA、PBS、GFPmRNA分别以50μg/mL与imDC在电转杯中混合。均在300V、500uS的条件下进行电转染。电转染后静置5min，将细胞移入6孔培养板中继续培养。另一组为imDC与上述浓度的人肝癌细胞总RNA混合，两组均培养3d即为mDC。1.2.4T细胞的获得按上述获得单核细胞的方法，取非贴壁细胞即为淋巴细胞，将3×107/mL的淋巴细胞注入尼龙毛柱，放入37℃，5%CO2培养箱静置1h。用预温的37℃含20%小牛血清RP

8、MI1640培养液洗柱，洗下的即为T细胞，并将其放入上述培养液和细胞因子rhIL2500U/mL；于37℃和5%CO2饱和湿度条件下培养待用。1.2.5mDC促进T细胞增殖实验用T细胞培养液悬浮上述T细胞为2×105/100μL，以100μL/孔加入96孔板，作为反应细胞。分别取5×106/mL电转染人总RNA的mDC和与肝癌细胞总RNA共培养的mDC作为实验1组和实验2组，经电转染PBS的mD