以gfp为标记的肝癌细胞rna转染树突状细胞的体外效应论文

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1、以GFP为标记的肝癌细胞RNA转染树突状细胞的体外效应论文张利旺，张红梅，刘文超，潘伯荣，斯晓明，任军【关键词】树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染Effectofdendriticcellstransfectedarkerinvitro【Abstract】AIM:ToinvestigatethefeasibilityofGFPasamarkertoobservethedendriticcells(DCs)transfectedorcellsandthefeasibilityofthetransfectedDCsservingasava

2、ccineforpotentialimmunotherapy.METHODS:PlasmidpGFPC3theHepG2GFPusingTrizol;DCsononuclearcells(PBMCs),andtransfectedicroscope,thechangesofphenotypeetry,andthechangeofIL12secretioninthesupernatantofDCsicroscope,sodidDCstransfectedembranemoleculessuchasCD80(13.2%to86.7%),HLA

3、DR(38.9%to97.9%),CD83(0.9%to97.1%),CD86(31.2%to92.5%)atically,IL12secretioninthesupernatantarkertoobservetheeffectoftransfectionofDCsorcellRNA.DCstransfectedorcellRNAmayserveasapromisingvaccineofimmunotherapy.【Keya,HCC)是一种常见的恶性肿瘤，适合手术治疗的患者只占一少部分，具有较高的复发率，预后很差，严重威胁人类健康［1］.

4、DCs(dendriticcells,DCs)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞，它能够高效的摄取、处理抗原，并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞，引起针对该抗原的特异性免疫反应［2］.国内外类似的研究中，都没有明确的可以观察肿瘤RNA转染DCs效果的指标，我们应用绿色荧光蛋白质粒载体pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA转染DCs，观察转染后DCs绿色荧光蛋白表达及特异性表面标志及功能相关分子表达，检测其上清细胞因子分泌，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性.1材料和方法1.1材料肝癌患者外周血单个核细胞来源

5、于我科造血干细胞移植患者；HepG2肝癌细胞株由我科常规传代培养.流式细胞仪（BD），DG3022A型酶联免疫检测仪（华东电子管厂），荧光显微镜OptiphotXIF（Nicon）等均为我院常备.FITCCD80，FITCHLADR，PECD83，PECD86抗体购自BD公司；rhGMCSF，rhIL4购自Peprorotec公司；TNFα购自我校生物技术中心；绿色荧光蛋白载体pGFPC3由陕西省肿瘤医院贾军博士惠赠；脂质体Transfection2000，TrizolReagent购自Invitrogen；RPMI1640培养基、胎牛血

6、清、G418购自Gibco公司，Xvivo无血清培养基购自BioTT购自Sigma公司.1.2方法参照Transfection2000说明书，pGFPC3转染HepG2，G418筛选2mon.筛选细胞命名HepG2GFP，荧光显微镜下观察.Trizol试剂提取HepG2GFP总RNA，紫外灯下观察，-80℃冻存备用.同样方法提取HepG2总RNA.取肝癌患者造血干细胞分离液，贴壁法分离单核细胞，贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF，rhIL4作用下，诱导DCs.倒置显微镜、电子显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型.1.2.1转染树突状细

7、胞收集培养4d的DCs，转入6孔板，转染HepG2GFP总RNA.另设转染HepG2总RNA及空白对照组.继续培养48h.荧光显微镜下观察.1.2.2细胞因子分泌的测定48h后，收集各组DCs上清，ELISA法检测转染前后各组细胞上清中IL12分泌量.1.2.3CTL效应收集各组DCs，30Gy60Co照射后与复苏冻存的非贴壁细胞按20∶1比例混合接种于24孔板，培养5d，收集的细胞即为效应细胞.收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按20∶1比例混合接种于96孔板.同时设单一靶细胞组、单一效应细胞组.培养24h后，

8、MTT法检测.以下述公式计算杀伤效率.CTL杀伤效率=［1-（效靶A490-效应细胞A490）/靶细胞A490］×100%.统计学方法：结果采用SPSS10.0统计软件分析.2结果2.1Hep