信号传导阻滞剂ag490对膀胱癌细胞侵袭转移的影响及其机制研究

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1、信号传导阻滞剂AG490对膀胱癌细胞侵袭转移的影响及其机制研究姚林方1(通讯作者)叶章群2陈志强2甘卫东1郭宏骞1(1南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科江苏南京210008)(2华屮科技大学同济医学院附属同济医院泌鉍外科湖北武汉430030)【摘要】目的观察AG490对膀胱癌细胞侵袭转移的影响，探讨通过药物阻断STAT3信号转导通路在抑制膀胱癌细胞侵袭转移屮的作用。方法应用AG490处理膀胱癌细胞系BIU-87,以肿瘤侵袭模型检测膀胱癌细胞侵袭转移能力，以免疫组织化学SP法检测肿瘤微血管密度(MVD),Westernblot检测p-」AK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达水平，反转

2、录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP-2)及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达。结果AG490抑制STAT3单体活化为p-STAT3,明显抑制膀胱癌细胞侵袭能力，裸鼠皮下移植瘤MVD值在AG490组(34.8+2.5｝显著低于对照组［(46.2+6.6),P<0.01］,抑瘤率达74.49%;并抑制MMP-2、VEGFmRNA的表达，同时上调TIMP-2mRNA的表达。结论AG490通过阻断STAT3通路，抑制膀胱癌细胞的侵袭和转移。病理性肿瘤血管生成减少及MMP-2、TIMP-2、VEGF表达改变与A

3、G490抗肿瘤侵袭转移作用密切相关。【关键词】膀胱癌AG490信号转导通路肿瘤侵袭【中图分类号】R73-37【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2012)15-0122-02STAT3信号转导通路异常活化与细胞异常増殖和恶性转化密切相关［1］。研究发现JAK(Januskinase)激酶抑制剂α-氰基-(3，4-释基)N-辛苯乙烯胺(AG490)可特异性阻断STAT3信号转导通路，是该通路的特异性阻滞剂［2］。本研究H在观察AG490对STAT3通路以及膀胱癌细胞侵袭转移的影响，探讨通过药物阻断STAT3信号转导通路在抑制膀胱癌细胞侵袭转移屮的作用。材料和方法1

4、.材料：膀胱癌细胞系BIU-87（编号：GDC120）购自中国典型培养物保藏中心，用含10%胎牛血清（天津TBD公司）的完全RPMI1640培养液（美国Gibco公司），在37°C、5%CO2培养箱中培养。BALB/c裸小鼠（nu/nu）购自中国科学院上海实验动物中心，雄性，4〜6周龄，体重18〜22g。AG490为美国Calbiochem公司产品（M.W.=294.3，批号：658401）。Chemicon细胞侵袭试剂盒购自美国Chemicon公司。兔抗人FVID因子相关抗原（FVIDRAg）多克隆抗体为美国Zymed公司产品。Trizol试剂购自美国Gibco/Brl公司。

5、Westernblot釆用一抗（美国SantaCmz公司）和碱性磷酸酶标记的二抗（北京中杉金桥生物技术奋限公司）。RT-PCR试剂盒购于Fermentas公司。2.细胞侵袭能力的检测：用无血清RPMI1640培养基水化Chemicon小室的基底膜，在放置有Chemicon小室的孔中加入500μl按1:1混合的条件培养液和完全培养液，在小室内加入300μl肿瘤细胞悬液，密度为1.0×106个/ml,实验组加入AG490溶液至终浓度为100μmol/L,对照组加入等体积溶剂，37°C、5%CO2培养箱中分别培养24、48、72h后取出Chemicon小

6、室，擦净小室内层的未穿透细胞，磷酸盐缓冲溶液漂洗后95%乙醇固定，苏木素染色，漂洗风干后在倒置显微镜下计数10个视野内的穿透微孔膜的细胞，取均值。每组重复4个样本。3.膀胱癌体内侵袭模型：用碘伏消毒裸鼠接种部位，用带6号针头的注射器抽取膀胱癌细胞悬液接种于裸鼠背部皮下，每个部位注射0.2ml（含5×106个活细胞），待瘤块直径达0.5〜1.0cm吋，即将动物随机分组，每组6只。实验组腹腔注射AG490溶液，每次注射10mg/kg体重。对照组腹腔注射相应溶剂。以上两组均隔日注射1次，4d测肿瘤体积1次，用药21d颈椎脱位处死裸鼠，完整剥离瘤体，分别称量瘤重。肿瘤体积（cm3）

7、以长×宽2×0.5计算。抑瘤率（％）=（1-用药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重）×100%o4.肿瘤微血管密度（MVD）检测:组织标本常规石蜡包埋、切片,SP法行FVDlRAg因子免疫组织化学染色。采用Weidner计数方法，在低倍镜下选择5个血管染色最密集区域，计数微血管数量，取平均值。1.Westernblot法:参照美国SantaCruz公司提供的蛋白提取方法，收集细胞后用细胞裂解缓冲液（50mmol/