peg5000修饰后假丝酵母尿酸酶的基本特性

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1、PEG5000修饰后假丝酵母尿酸酶的基本特性：孙晓军金磊甘志勇刘冬【摘要】　　目的研究天然尿酸酶与PEG化尿酸酶的基本特性，为治疗高尿酸血症相关疾病药物做基础研究。方法用相对分子量5kD,活化基团为羟基琥珀亚氨的PEG作为专一性修饰剂对尿酸酶进行修饰，采用常规酶学分析方法，分别研究天然尿酸酶与PEG化尿酸酶的动力学参数，并比较修饰前后对抑制剂黄嘌呤的敏感性、最适温度、最适pH值、37℃时的稳定性以及在体半衰期等方面的差异。结果经PEG修饰后尿酸酶最适温度由30℃升为35℃，最适pH无改变仍为pH8.7；在37℃水浴下,24h后活性保留由40%增至70

2、%，酶稳定性提高，体内半衰期由45min延长至11h；测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的Km分别为32.40、36.34μmol/L，黄嘌呤对尿酸酶与PEG化尿酸酶抑制常数分别为4.72、11.30μmol/L。结论假丝酵母尿酸酶经PEG5kD修饰后有药用潜力。【关键词】高尿酸血症；尿酸酶；PEG修饰；稳定性　　【Abstract】ObjectiveToresearchthebasiccharacteristicsofnaturaluricaseandPEGuricase,preparePEGuricase,modifytheCandidauricase

3、provethestabilityoftheCandidauricaseandextendthehalflifeofuricaseinvivo.MethodsPEG(relativemolecularmonia)odifiertomodifyuricase..C.C.2.1008）来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，尿酸来自AlfaAesar,黄嘌呤来自Avocado，DEAEcellulose52来自gSO40.05%,pH6.7)中〔10〕，28℃，240r/min振荡培养5～6h；在4℃4000r/min离心20min收集菌体，用

4、0.05mol/L硼酸缓冲液pH8.0悬浮菌体；在4℃下用MSE超声仪，间隔10s碎菌10s，持续40min；10000r/min离心15min收集上清，30%～90%硫酸铵4℃将粗酶液分级；10000r/min离心收集沉淀，0.05mol/L硼酸缓冲液4℃透析过夜；再将透析后的上清液过DEAEcellulose52纤维柱，收集酶活性部分。　　1.3PEG化尿酸酶的制备　　标定透析后尿酸酶的浓度与活性，取20ml0.2～0.3mg/ml的尿酸酶与PEG5000以摩尔比1∶200比例混合，于4℃混匀1h。　　1.4尿酸酶与PEG化尿酸酶的活力测定和

5、表征　　1.4.1酶活力测定　　反应体系1.2ml，含1.156ml硼酸盐缓冲液，溶解在二甲基亚砜3.75、尿酸0.024和0.050酶液样品中，在25℃条件下测定酶作用下293nm吸收变化初速度（延迟30s后共记录1.0min），每分钟氧化1.0μmol尿酸的酶量为1个单位。　　1.4.2尿酸酶与PEG化尿酸酶米氏常数的测定　　用pH8.8硼酸盐缓冲液反应体系，在25℃条件下测定10.0、20.0、40.0、60.0、80.0μmol/L终浓度尿酸下的初速度，用LineweaverBurkplot法回归分析初速度对底物浓度的影响以测定动力学参数。　

6、　1.4.3黄嘌呤对尿酸酶与PEG化尿酸酶抑制常数的测定　　用pH8.8硼酸盐缓冲液反应体系，在25℃测定黄嘌呤抑制作用，即回归动力学参数随着抑制剂浓度的变化，从而确定抑制类型和对应抑制常数。　　1.4.4最适pH测定　　将测酶活性缓冲液及尿酸配成pH7.2～9.0硼酸硼砂缓冲液，将酶分别预先加入缓冲液中25℃孵育1h，将尿酸同样放在25℃温浴1h，将二者混匀，按测定尿酸酶活性的方法测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性，以pH为横坐标，尿酸酶与PEG化尿酸酶相对活性为纵坐标作图。　　1.4.5最适温度的测定　　将待测的酶缓冲液和尿酸分别放置在5℃，10℃

7、，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃中，将酶预先放置在0℃，按测定尿酸酶活性的方法测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性。以温度为横坐标，尿酸酶与PEG化尿酸酶相对活性为纵坐标作图。　　1.4.6尿酸酶与PEG化尿酸酶在37℃时的稳定性测定　　将待测酶液放入37℃水浴温育，分别在1、2、4、6、8、12、14、16、18、20、24、27、33、48h按测定尿酸酶活性的方法测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性。以时间为横坐标，尿酸酶与PEG化尿酸酶相对活性为纵坐标作图。　　1.4.8实验组离体多次降尿酸实验评价尿酸酶的药效　　取大白兔(n=2)静脉血液约80

8、ml，离心获得血浆约20ml。用20ml血浆模拟体内环境，分装于5个5ml管中，加入一定的尿酸