白假丝酵母菌.doc

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1、选题的目的和意义：白假丝酵母菌为机会致病菌，存在于人的皮肤，口腔，上呼吸道，阴道及皮肤黏膜。当机体免疫力下降或长期使用抗生素引起的菌群失调等情况出现时，可引起皮肤、黏膜感染，内的染所致疾病的困难程度日益增大。[2]。白假丝酵母菌有两种生长状态，游离状态和生物膜状态。生物膜是一种粘附于生物或非生物表面的微生物菌落，它们包裹于自身产生的细胞外基质中，是微生物在生长过程中为适应生存环境而形成的一种于浮游细胞相对应的存在形式[1]。感染白假丝酵母菌后多有生物膜的形成。生物膜细胞对多数抗真菌药物有明显的耐药性，因此由白假丝酵母菌感染引起的疾病已构成临床医生和患

2、者棘手的问题【3】。壳聚糖是氨基多糖的天然高分子物质，壳寡糖(COS)是壳聚糖的降解产物。与壳聚糖相比，壳寡糖分子量小、易溶于水，极易被人体吸收。因此壳寡糖具有更独特的功能性质和生物活性。抗菌作用是壳寡糖的主要生理功能之一。本次实验就是来研究壳寡糖对白色念珠菌游离菌和生物膜菌的杀菌作用，以降低临床中真菌感染后难以治愈的困难。实验方案：1材料与方法1.1菌株分离、培养、鉴定及细菌悬液的制备取疑似真菌感染患者的分泌物（100例），直接涂片革兰染色，镜下观察并初步鉴定；标本立即接种于沙堡琼脂培养基，挑取可疑菌落涂片，革兰染色确认为酵母样真菌后，转种CHRO

3、Magar白假丝酵母菌显色培养基，翠绿色为白假丝酵母菌。从沙氏培养基上挑取单菌落实验菌株接种在YPD液体培养基上，37℃摇床培养24h,收集对数期生长状态的细胞，用PRMI-1640培养液配置浓度为1×107cell/ml，OD520nm=0.38的菌悬液。[4]1.2壳寡糖溶液取平均相对分子质量为2000的壳寡糖，将壳寡糖溶于无菌蒸馏水分别配成浓度为2.5、5、10、20、40g/L的溶液，高压消毒后备用。1.3配制菌液：将100μL10％牛血清PRMI-1640培养液加入无菌6孔板中，37℃孵育24h，无菌PBS冲洗3遍。加入100μL标准悬菌液

4、，对照组加入等体积培养液，37℃培养2h,无菌PBS冲洗3遍，洗去未粘附细胞。【5】1.3.2壳寡糖对白假丝酵母菌的抑制试验：在六孔板(2号）1-5孔中加入48h培养后的生物膜，然后加入3ml分子量为2000的壳寡糖溶液，浓度依次为2.5、5、10、20、40g/L,第6孔加入3ml无菌蒸馏水。作用时间为30min,弃去壳寡糖溶液，用无菌蒸馏水冲洗三次。加100μLPRMI-1640，每孔加入10μLCCK-8，避光容器内孵育2h后用酶标测450nm下的OD值。【6】再次取一个新的六孔板（3号），操作如上，将生物膜换成2h培养得到的游离菌。预期结果：

5、病原菌分离培养结果：可以分离出白假丝酵母菌,出现表面光滑，带有浓厚酵母气味的典型类酵母菌落。壳寡糖对白假丝酵母菌的抑制试验:比较两组中1-5孔和第6孔的OD值，可明显看出6号孔OD值大于1-5的OD值，说明壳寡糖对白假丝酵母菌生物膜的形成有抑制作用研究现状：綦成、张春燕、亓庆国[1]对白色念珠菌进行了生物膜形成的定量分析和形态学观察，实验表明，白色念珠菌可以在玻片上形成典型的城市的生物膜结构，形成过程经过了几个明显的阶段，白色念珠菌形成的生物膜具备典型的微生物生物膜结构。六孔细胞培养板和载玻片法生物膜形成实验过程表明两小时形成生物膜也是显示为孢子像多

6、为单个菌株分散存在；24小时生物膜基本成熟，48小时形成成熟的生物膜结构。隋凤湖[2]对白色念球菌疫苗进行了研究，研究表明:白色念球菌全菌疫苗对局部粘膜免疫有一定的作用。蛋白疫苗多肽疫苗，糖结合疫苗，DNA疫苗。不同形式的白色念珠菌疫苗应用都具有很好的免疫保护作用。从白色念珠菌感染过程中的关键分子和步骤入手，研究和开发一种技能激活固有性免疫诱导适应性免疫的疫苗，对预防越来越广泛的白色念珠菌病，以提高AIDS患者抗真菌感染的能力和生存能力都具有重要意义。《白色念球菌疫苗研究状态综述。米热尼沙等[3]人分析临床标本分离的白色念珠菌生物膜形成情况探讨其与耐

7、药的关系，为临床诊疗白色念珠菌感染提供可靠依据。研究发现，白色念珠菌生物膜的阳性率为75.0%，这使其对抗真菌药物的耐药性增加。白色念珠菌有生物膜者对抗真菌药物的耐药率明显高于无生物膜者。唐思魏等[4]人了解白假丝酵母菌感染菌株对抗真菌药物敏感情况，并探讨伊曲康唑对白假丝酵母菌生物膜形成的影响。体外药敏实验显示临床猪白色假丝酵母菌的对抗真菌药，两性霉素B和制霉素敏感性较高，45%、85%。而对康唑类抗真菌药物产生了耐药性。白假丝酵母菌对常用抗真菌药物的耐药性呈上升趋势，经抗菌性处理的生物材料对生物膜的形成有抑制作用。