大鼠脑发育过程中神经型一氧化氮合酶的表达变化

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1、大鼠脑发育过程中神经型一氧化氮合酶的表达变化【关键词】神经型一氧化氮合酶(nNOS)免疫组化脑发育大鼠　　ABSTRACT:ObjectiveToobservetheexpressionofneuronalnitricoxidesynthase(nNOS)duringthegromunohistochemicalmethod.MethodsFetalandnelyselected,anddividedinto6groupsaccordingtodevelopmentalstagesofE12,E15,E18,P0,P5andP10.Thes

2、ectionsmunohistochemicalstaining.ThedensityofnNOSimmunoreactivecellseasuredbyimagegatheringandanalysissoftandhippocampus.ResultsnNOSimmunoreactivecellsmunoreactivecells,andreducedsequentiallyatP5andP10.Inthehippocampus,thenumberofnNOSimmunoreativecellsatP5andP10munohistoch

3、emicalstainingisnegativeattelencephaloninfetalrats.entofthecortexandstriatum,theexpressionofnNOSdeclinesinnepusduringthegromunohistochemistry;braindevelopment;rat　　在神经系统中，一氧化氮(nitricoxide,NO)不仅在神经细胞间起着神经递质的作用，而且是中枢神经系统的信使物质，可能与脑细胞的发育、脑细胞的学习和记忆过程及脑缺血时调整脑血供应等有关。近年来，与NO合成相关的一

4、氧化氮合酶(NOS)越来越受到研究人员的重视。目前，在生物组织中已经确定的NOS有三种亚型，即神经型NOS(neuronalNOS,nNOS)、内皮型NOS(endothelialNOS,eNOS)和有病理意义的诱导型NOS(inducibleNOS,iNOS)。其中脑中的nNOS主要是一种可溶性的胞质酶，分子量为150-160ku，主要在神经元中表达。本实验应用免疫组化技术，研究nNOS在大鼠大脑皮层、纹状体及海马发育过程中表达的变化，为进一步探讨其在中枢神经系统发育过程中的作用提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1试剂兔抗nNOS多克

5、隆抗体，购自北京中杉金桥生物科技有限公司，SABC即用型试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，DAB显色剂购自美国sigma公司。　　1.2实验动物随机选用体重250-300g的SD大鼠雌、雄各数只，于晚8:00以后雌雄合笼，保证同一笼中只有一只雄鼠，若干雌鼠。于次日早8:00以前，雌雄分笼，并观察雌鼠阴道口。若存在阴栓，为配种成功的标志。未配种成功的雌鼠继续于当晚与雄鼠合笼，并继续观察，直至配种成功。　　1.3组织取材胚鼠：将孕12、15、18d的雌鼠，按350mg/kg体重腹腔注射100g/L水合氯醛，动物麻醉成功后，开腹，寻找子宫，并迅速

6、各取下3只胚胎，置于0.01mol/L的PBS溶液(pH7.4)中，快速取脑，置于包氏液在4℃冰箱中固定。新生鼠：分别于生后24h以内(P0)、生后5d(P5)及生后10d(P10)随机各选取3只，迅速断头取脑，置于包氏液4℃冰箱中固定。　　1.4冰冻切片制备包氏液中充分固定的脑组织，置于700mL/L酒精中充分洗脱，后置300g/L蔗糖溶液中4℃沉降，待组织沉底后，OCT包埋，入-26℃恒冷箱切片机，隔3取1制成20μm厚冠状切片，-30℃保存备用。　　1.5组织染色　　1.5.1尼氏染色将制备好的冰冻切片吹干后，入焦油紫中孵育10min

7、，常规水洗，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。　　1.5.2免疫组化染色将冰冻切片吹干后，在30mL/LH2O2溶液(甲醇配)中室温孵育15min；3mL/LTritonX100溶液中室温孵育30min；50g/LBSA室温孵育20min，甩去不洗；滴加1∶100兔抗nNOS多克隆抗体，4℃过夜；次日滴加生物素化的羊抗兔IgG，37℃孵育2h；滴加SABC，37℃孵育30min。以上各步骤之间用0.01mol/L的PBS溶液(pH7.4)彻底漂洗。最后DAB显色，10min左右终止显色；酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。　　1.5

8、.3空白对照实验用PBS替代一抗孵育切片，结果为阴性。　　1.6图像分析与统计方法ImageProPlus图像分析软件，测定大脑皮层、纹状体及海马单位面积nNOS阳性细胞的密度