大鼠空肠黏膜上皮细胞酪酪肽受体的分布与特性

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1、大鼠空肠黏膜上皮细胞酪酪肽受体的分布与特性【关键词】酪酪肽受体；酪酪肽；平衡解离常数；最大结合容量；胃肠激素ABSTRACT:ObjectiveTodetectnormalratjejunumepithelialcellstolearnaboutthedistributionofpeptideYY(PYY)receptorandmeasuredtportantparametersofPYYreceptorsoastoexplorethetargetthatPYYbindstoanddisplayitsphysiolo

2、gicalfunction.MethodsReceptorradioligandassayalratjejunumepithelialcells.aximumbindingcapacity(Bmax)ol/mgprotein.Hillcoefficientalratjejunumepithelialcells.KdmeansthatPYYreceptorhashighaffinity.Bmaxmeansthatthenumberofreceptorsislimitedanddecidesthecharactersof

3、saturability.epithelialcellssecretion.KEYaximumbindingcapacity(Bmax);gastrointestinalhormone酪酪肽(peptideYY,PYY)是近年发现的一种胃肠激素，它与血管活性肠肽(vasoactiveintestinalpeptide,VIP)、胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)等胃肠激素一样属于肽类激素，是消化系统乃至整个机体的一种重要调节肽。PYY对消化道有多种重要的生物学效应，如抑制肠黏膜分泌、影响消化道运动、

4、刺激肠上皮增生、抑制胃酸及胰腺外分泌、影响摄食行为等[1]。PYY的这些生物学效应是通过作用于酪酪肽受体，激发细胞内下游信号分子而实现的[2]。但是，该过程的具体作用机制目前还不清楚，可能涉及黏膜上皮细胞、肠神经系统及中枢神经系统。通过测定正常大鼠空肠黏膜上皮细胞酪酪肽受体的分布，受体的亲和力及分布密度，以了解PYY在消化道的作用位点、结合特征和作用方式，对阐明PYY的作用机制及在消化道复杂调节网络中的作用有一定的意义。通过对正常个体酪酪肽受体分布和特征的了解，以分辨一些疾病的发生是否由于受体分布区域、分布密度及信号

5、转导异常引起的，对揭示疾病病因和病理生理机制提供帮助。1材料与方法1.1研究对象选择成年雄性健康SpragueDamol)由美国PerkinElmer公司生产，PYY由美国Phoenixpeptide公司生产，杆菌肽购于美国Sigma公司。1.3制备大鼠空肠黏膜上皮细胞膜的标本断头法处死健康成年雄性SD大鼠，迅速取出空肠，用4℃、0.24mol/LNaCl冲洗干净，翻转肠管，用0.34mol/LNaCl充盈结扎两端，使黏膜面充分暴露。置入离散液中持续振荡10min，弃去肠管，将剩余液体装入离心管。2000g离心5m

6、in，弃去上清液，保留沉淀。向沉淀中加入KrebRinger磷酸缓冲液冲洗后，2000g离心5min，保留沉淀。重复冲洗1次。取沉淀置于匀浆管，低温高速匀化1min。将匀浆1500g离心20min，弃去沉淀，保留上清液。上清液20000g离心20min，弃去上清液，保留沉淀。向沉淀中加入60mmol/LHEPES缓冲液冲洗后，20000g离心20min，保留沉淀。沉淀即为空肠黏膜上皮细胞膜，立即保存于液氮罐中备用。以上所有操作均在冰上进行，保证整个操作过程均在4℃以下，以保持受体活性。所有液体均需要放在4℃冰箱预冷

7、。1.4测定大鼠空肠黏膜上皮细胞膜蛋白的浓度液氮罐中取出大鼠空肠黏膜上皮细胞膜，用HEPES缓冲液充分溶解，考马斯亮兰法测定大鼠空肠黏膜上皮细胞膜蛋白浓度，紫外分光光度计595nm处测量，获得A值。细胞膜蛋白浓度=(A测定管吸光值÷A标准管吸光值)×标准蛋白液浓度。1.5受体放射配基结合分析方法测定正常大鼠空肠黏膜的酪酪肽受体设定反应管和对照管两组，每组设10个反应浓度。两组均加入已测定蛋白浓度的细胞膜液。反应管中将PYY按照由低到高浓度(1pmol/L～1μmol/L)依次加入，再加入0.05nmol/L125I

8、PYY；对照管中将PYY按照由低到高浓度(1pmol/L～1μmol/L)依次加入后，均再加入0.1μmol/LPYY(此步骤使酪酪肽受体被非标记配体完全占领，从而显现非特异性结合)，再加入0.05nmol/L125I–PYY。充分混合，15℃温孵2h后，加入冰冷的HEPES缓冲液终止反应。20000g离心，弃去上清液，将沉淀进行γ计数。每次反