溃疡性结肠炎大鼠血清酪酪肽水平及其受体特性的测定

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1、溃疡性结肠炎大鼠血清酪酪肽水平及其受体特性的测定：潘淑波，刘欣，龚均，董蕾，王景林【摘要】　　目的通过测定溃疡性结肠炎(UC)大鼠血清酪酪肽(PYY)水平及其空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的特性来观察UC时血清PYY水平及其受体的变化。方法将大鼠随机分成UC组、腹泻型肠易激综合征(DIBS)组及对照组，用同位素放射免疫法分别检测各组的PYY水平及反映受体特性的两个参数：平衡解离常数(Kd)和最大结合容量值(Bmax)。结果UC及DIBS组血清PYY水平高于对照组(P<0.001)，且UC组亦高于DIBS组(P<0.001)；但UC组Kd及Bmax值与正常组和DIBS

2、组比较均无明显差异(P>0.05)。结论UC组PYY水平高于正常及DIBS组，推测UC时PYY水平的变化可能与其腹泻症状和炎症病变的产生有关；UC组的Kd及Bmax与正常组比较无显著变化，推测UC可能与PYY受体的变化无关。【关键词】溃疡性结肠炎；胃肠激素；酪酪肽；酪酪肽受体　　ABSTRACT:ObjectiveToobservethechangesofpeptideYY(PYY)anditsreceptorsinratslevelofPYYandjejunumepithelialcellsinUCrats.MethodsRatslydividedintoUCgroup,d

3、iarrheairritableboe(DIBS)groupandcontrolgroup.ADZU(日本)；FM200010γ免疫计数器(西安凯普机电有限责任公司)；PYY放免试剂盒，PYY，125IPYY比活度2200Ci/mmol以及50mL/L2，4，6三硝基苯磺酸(TNBS)均购于SIGMA公司；考马斯亮蓝蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所)。　　1.3实验动物的分组　　按照随机分配的原则将实验动物分成三组，即UC组、腹泻型肠易激综合征(diarrheairritableboe,DIBS)模型大鼠组和正常对照组,每组各10只。　　1.4模型的建立　　①UC大鼠

4、模型的制备[8]：用50mL/L三硝基苯磺酸(TNBS)与无水乙醇以体积1∶1配成25g(TNBS)/L的混合液；实验前禁食24h，乙醚吸入麻醉后经肛门插入硅胶管(距肛门8cm)，按相应体重比例灌入配好的混合液(100mg/kg)，然后再注入一段空气，用手压迫肛门并将大鼠尾巴抬高30s，造模后大鼠仰卧归笼，同时每天观察大鼠的情况。根据文献[8]，UC组大鼠在第7天结肠长度缩短及溃疡分数增加程度最为明显，遂于造模第7天处死大鼠，剖取距肛门5～9cm结肠段，沿纵轴剪开，冰生理盐水反复冲洗后，可发现明显的溃疡形成。②阳性对照(DIBS模型大鼠)的制备[910]：实验前12h禁食，实验第

5、1天给大鼠称重，乙醚吸入麻醉后经肛门插入硅胶管(距肛门8cm)，结肠内灌入40mL/L的乙酸1mL。缓慢拔出硅胶管，用手压迫肛门并将大鼠尾巴抬高30s，然后用生理盐水冲洗结肠。恢复6d。根据文献[10]乙酸灌肠后第7天结肠组织学恢复正常，但大鼠对结、直肠扩张刺激的敏感性仍持续增高，遂于实验第7天行束缚应激3h。收集应激期3h内的大鼠粪便，与正常大鼠比较，若粪粒数、粪便湿重和粪便含水量较对照组增多，表明造模成功。③正常对照组：置于安静环境中喂养，自由饮水，摄食，第7天处死大鼠。　　1.5血清PYY激素水平的测定　　处死各组大鼠前分别采其腹主动脉血，离心后获得血清，用同位素放射免疫法检测

6、各组大鼠血清内的PYY激素水平。　　1.6大鼠空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的测定　　①按参考文献[1112]制备大鼠空肠黏膜上皮细胞膜标本；②用考马斯亮蓝法测定大鼠空肠黏膜上皮细胞膜蛋白的浓度；③受体放射配基结合分析方法测定大鼠空肠黏膜PYY受体：模型组和对照组分别设定反应管和对照管两组，每组设10个反应浓度；两组均加入已测定蛋白浓度的细胞膜液；反应管中将PYY按照由低到高浓度(1pmol/L～1μmol/L)依次加入后，再加入0.05nmol/L125IPYY；对照管中将PYY按照由低到高浓度(1pmol/L～1μmol/L)依次加入后，均再加入0.1μmol/L浓度PYY，0

7、.05nmol/L125IPYY；充分混合后，15℃温孵2h后，加入冰冷HEPES缓冲液终止反应；2000g离心，弃去上清液，将沉淀进行γ计数。空肠黏膜富含酶类物质，加入杆菌肽抑制酶类破坏受体。反应管为总结合，对照管为非特异结合，受体的特异结合=总结合-非特异结合。将得到的PYY受体特异结合数值换算成特异结合百分率(specificbinding,%)做纵坐标，以非标记配体浓度的对数值(Logmol/L)做横坐标，应用Excel制图软件得到竞争抑制曲线，