hsp70,toll样受体4抗体与自身免疫性内耳病的关系

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1、Hsp70,Toll样受体4抗体与自身免疫性内耳病的关系【关键词】热休克蛋白70抗体自身免疫疾病耳蜗豚鼠0引言有研究表明Toll样受体4（Tolllikereceptor4,TLR4）可能介导热休克蛋白70（Hsp70）的信号传导，Hsp70是TLR4的内源性配体［1］.我们以同种异体内耳组织为抗原免疫豚鼠，建立一种高阳性率听力损害的自身免疫性内耳病（autoimmuneinnereardisease,AIED）的动物模型，在鼓室注射Toll样受体4阻断剂即Toll样受体4抗体前后，观察模型动物耳蜗组织中的Hsp70表达情况.1材料和方法1.1材料耳廓反射正常、无中耳感

2、染、体质量250～400g的健康、白色、短毛、红目豚鼠75只，雌雄不拘（重庆医科大学动物实验中心）.其中25只用于提制内耳抗原，其余50只随机分为实验组［20只，给予环磷酰胺（CTX）和粗制内耳抗原接种处理］；处理组（10只，给予CTX和粗制内耳抗原接种处理后施加干预因素Toll样受体4抗体）；对照1组（10只，只给予CTX预处理）；对照2组（10只，不施加任何因素），分笼后适应性喂养1anTLR4（HTA125），美国eBioscience公司］；苯甲基磺酰氟（PMSF，碧云天生物技术研究所）；鼠抗Hsp70mAb、弗氏完全佐剂(CFA)（美国Sigma公司），大鼠抗核

3、因子кB（p65）mAb（SantaCruz公司），均由北京中山公司分装；TNFαELISA试剂盒（晶美公司）；抑肽酶、DAB显色系列购自北京中山公司；CTX购自重庆医科大学附属一院药房.1.2方法1.2.1内耳抗原的提制豚鼠25只，用速眠新0.1mL/kg肌肉注射麻醉后断头处死,参照文献［2］的方法提制粗制内耳抗原液，用酶标仪检测内耳抗原液浓度，并在-70℃分装保存备用.1.2.2免疫动物将实验组豚鼠腹腔注射CTX(150mg/kg)进行预处理，2d后对每只豚鼠用粗制内耳抗原液与弗氏完全佐剂等量乳化液400μg粗制内耳抗原蛋白量共0.2mL进行颈、背部、足部皮内多点注

4、射接种［2］.处理组按实验组的方法免疫豚鼠，2d后每只豚鼠经鼓室注射TLR4阻断剂100μg.1.2.3内耳石蜡切片的制作将动物麻醉后快速断头，取出听泡，经40mg/L多聚甲醛固定，100mg/LEDTANa2脱钙后，OCT包埋标本，沿耳蜗中轴切片，片厚5μm.1.2.4检测指标1.2.4.1听性脑干反应（ABR）测试所有动物在免疫前均行ABR测试,实验组动物免疫后1s，滤波带宽100～300Hz，信号叠加1000次，以ABR波Ⅲ反应阈为标准判断听阈.1.2.4.2豚鼠耳蜗Hsp70的表达取实验组动物听阈超过10dB的10耳，并随机选取处理组和对照组的10耳，耳蜗切片做

5、免疫组化染色（SABC法）.切片用0.3mL/L甲醇H2O2液处理；山羊血清封闭；加一抗（鼠抗Hsp70mAb1∶100）37℃孵育1h，并用普通小鼠IgG(1∶100)取代一抗作阴性对照；滴加二抗（生物素化羊抗小鼠IgG,即用型）在37℃反应30min；二氨基联苯胺（DAB）显色，常规脱水、透明、中性树胶封片.胞核及胞质呈棕黄色染色为阳性.在上述各组的切片中,每耳分别随机抽出1张近中轴的切片,做统计学分析.每张切片随机选取10个视野计数300个螺旋神经节细胞，依照阳性细胞百分比判断，阳性率<10%(-)、阳性率10%~25%(+)、阳性率26%~50%()、阳

6、性率>50%().1.2.4.3耳蜗中NFκB（p65）的表达用SABC法，方法及结果判定同上,以缓冲液代替一抗作阴性对照.1.2.4.4内耳TNFα的表达用ELISA夹心法，应用豚鼠TNFαELISA试剂盒，严格按照产品说明进行操作,酶标仪检测A值，得出标准曲线，求出各浓度值.1.2.4.5血清中抗Hsp70抗体的测定取实验组听阈提高>10dB的和对照组的动物血清，滴加豚鼠血清IgG，发生凝集反应为阳性.统计学处理：数据输入SPSS10.0统计软件，所有实验组均进行正态性检验和方差齐性分析，多个样本均数的比较用单因素方差分析，均数两两比较用Stude

7、ntNewKeulsq检验.2结果2.1ABR测定在动物接种后7d，实验组40耳中波Ⅲ反应阈34耳提高≥10dB,6耳提高<10dB,听阈提高率为85%.其中听阈提高10dB者18耳,15dB者10耳,20dB者4耳,25及40dB者各1耳.阈值为（75.8±15.0）dB声压级，与正常对照组比较有统计学差异（P<0.01）;正常对照1组和2组7d时听阈提高≥10dB者为0耳,ABR阈值分别为（55.1±3.7）,（54.2±4.8）dB声压级,两组间无统计学差异；处理组7d后听阈降低10dB者有10耳,AB