eb1基因表达与胚胎染色体数目异常的关系

《eb1基因表达与胚胎染色体数目异常的关系》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、EB1基因表达与胚胎染色体数目异常的关系：刘青松，翁亚光，杨戎，施琼，蔡燕，刘子杰，徐远久，蒋宏彦【摘要】目的研究EB1基因在胚胎绒毛细胞中的表达，并分析其对染色体分离的影响。方法采用荧光定量PCR技术检测EB1基因在人工流产绒毛核型分析正常的胚胎细胞和自然流产绒毛核型分析异常的胚胎细胞中的表达差异；免疫组织化学方法检测EB1蛋白在两者中的表达情况，并用ethodsEndogenousEB1mRNAandproteinlevelsinembryoniccellsoftrophonemafromartificialabortionandspontaneousabortionmunohistoc

2、hemistryandRNA/GAPDHmRNAerthanthelatter.ConclusionTheexpressionofEB1issignificantlyhigherinembryoniccellsoftrophonemafromspontaneousabortionthanfromartificialabortion,andtheincreasedexpressionofEB1mayleadtoabnormalityofchromosomesegregation.　　KEY109，来自重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室。　　1.2主要试剂和仪器DMEM和RPMI1640

3、培养基由临床检验诊断学教育部重点实验室供应室自行配制；CK抗体和波形蛋白抗体购自北京中山公司；质粒大抽试剂盒EndoFreePlasmidMaxiKit购自QIAGEN公司；定量PCR所用探针由上海Genecore合成；特优级血清购自Hyclon公司；EB1蛋白一抗购自Santacruz公司；免疫化学试剂盒购自北京中山生物试剂公司；OmniscriptReverseTranscriptase试剂盒购自QIAGEN；PlatinumTaqpolymerase和T载体试剂盒购自TaKaRa公司；Biorad.电转仪、RTPCR仪为美国MJ公司生产的OpticonMonitor2；FQPCR仪

4、为美国IBA7000。　　1.3标本及分组在重庆医科大学两所附属医院共获得45例人工流产、85例自然流产的胚胎组织(妊娠3个月内)，孕妇无有毒有害物质接触史。所有胚胎组织经过胚胎细胞原代培养，并进行染色体核型分析后，在其中筛选到33例人工流产染色体数目正常的胚胎(对照组)和28例自然流产染色体数目异常的胚胎(实验组)，分别提取总RNA，用于分析EB1基因的表达。用培养后剩余的组织分别提取总蛋白和进行石蜡包埋，进行EB1蛋白表达分析。　　1.4细胞的培养及鉴定所有器械进行无菌处理后，立即对胚胎组织进行洗涤和分选，获取其绒毛组织。基础培养液是DMEM(低糖)，胎牛血清含量为20%(体积分数)，原

5、代细胞培养7-10d进行传代，以后每次传代细胞的时间为3-4d。采用细胞免疫化学的方法，用CK7抗体鉴定绒毛滋养层细胞为阳性，而非滋养层细胞为阴性；相反波形蛋白抗体作为阴性对照，鉴定绒毛滋养层细胞为阴性，而非滋养层细胞为阳性，鉴定细胞为3-5代的细胞。　　1.5染色体标本的制备和分析①制备方法：培养3-5代的细胞收获前6-9h加入秋水仙素，按照常规方法制备染色体标本，对每个标本进行染色体分析。②染色体分析标准：在进行核型分析时，对人工流产滋养层细胞，当标本中出现染色体数目异常，但未见2个相同异常核型的标本，根据染色体数目分析的国际标准，这种异常主要是由于制片引起，而非组织细胞自身异常，该标本

6、视为染色体正常；对自然流产滋养层细胞，当标本中染色体数目异常细胞较多，无法区分是由于制片原因还是组织细胞自身异常所致时，视为该标本染色体异常。实验结果显示，在自然流产滋养层细胞染色体数目异常有三倍体、四倍体、单个染色体增多和染色体缺失等几种情况，其中以三倍体(16例)和单个染色体增多(9例)为主。　　1.6FQPCR测定EB1基因mRNA水平　　1.6.1总RNA提取、逆转录和FQPCR①1mLTRIZOL将约106个细胞充分匀浆，以氯仿、异丙醇抽提、沉淀，具体步骤按说明书进行。所得总RNA用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳判断RNA的完整性。②逆转录：总RNA

7、5μL和100μmoL/Loligo(dT)183μL，70℃变性5min，加入5μL5×RT缓冲液、2μL10mmol/LdNTP、25uRnasin、200uMMLV逆转录酶，加水致25μL混匀，42℃60min，最后70℃10min，产物用于PCR。③FQPCR反应体积为25μL，反应条件：94℃10min1个循环；94℃30s，57℃1min40个循环，在57℃1min处收集荧光。　　1.6.2E