mad2、bub1在自然流产染色体数目异常胚胎中的表达

mad2、bub1在自然流产染色体数目异常胚胎中的表达

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1、郑州大学硕士学位论文MAD2、BUB1在自然流产染色体数目异常胚胎中的表达姓名:邢金芳申请学位级别:硕士专业:临床检验诊断学指导教师:贾莉婷201205摘要MAD2,BUBl在自然流产染色体数目异常胚胎中的表达硕士研究生:邢金芳导师:贾莉婷专业:临床检验诊断学郑州大学第三临床学院河南郑州450052自然流产占全部妊娠的10%,--15%,由遗传、免疫、感染、解剖、内分泌、环境等因素引起,遗传因素中的染色体异常占所有自然流产的50%~60%。染色体异常分为数目异常和结构异常,约86%为数目异常,结构

2、异常仅6%,包括嵌合型在内的其它异常占8%。染色体异常可能源于配子生成前的有丝分裂、配子生成的减数分裂或受精卵最初几次有丝分裂,是自然流产、出生缺陷的主要原因。人体的所有细胞均来源于两个单倍体配子形成的受精卵,即:配子的染色体异常可导致所有的子代细胞染色体出现异常;卵裂早期部分细胞出现染色体异常可导致嵌合型,而且发生越早,受影响的子细胞越多。因此,在配子生成、受精和卵裂过程中维持基因组的完整性对于人类胚胎正常发育至关重要。单个受精卵发育成一个由多种细胞、组织和器官组成的个体是通过细胞增殖周期实现的

3、。细胞周期分为Gl、S、G2和M期(前、中、后和末期),是在多个检验点的严格监控下、由一系列连续事件按精确时间顺序进行的动态过程,其中纺锤体组装检验点(spindleassemblycheckpoint,SAC)主要作用是监控细胞分裂中期所有染色体与纺锤体微管正确连接并排列在细胞赤道面上,细胞方能进入分裂后期,保证染色体能够精确地分配到子细胞中,防止子细胞染色体出现数目异常,以维持基因组的完整性。MAD2,BUBl编码的蛋白是SAC主要成份。MAD2作用是结合MADl并被募摘要集到动粒,随后发生构

4、象改变,转变成C.MAD2后,与Cdc20、BUBRl、BUB3形成有丝分裂检查点复合物(mitoticcheckpointcomplex,MCC),MCC与后期促进复合物(anaphasepromotingcomplex,APC/C)相互作用并抑制其泛素连接酶活性,使其不能靶向降解securin(人类为hPTTG)和cyclinB,细胞不能进入分裂后期,以提供时间改J下不正确的动粒.微管连接,防止染色体分离错误。BUBl是结合BUB3的蛋白激酶,有三个主要区域:N末端保守区域作用是定位动粒;非保

5、守区域作用是结合BUB3;C一末端区域作用是催化丝氨酸/苏氨酸激酶。BUBl对于细胞分裂中期染色体中板集合是必须的,具体作用:建立并/或维持有效的纺锤体微管双极连接;监控微管连接到动粒:募集MAD2、BUBRl和着丝粒相关蛋I兰tCENP—E、CENP.F蛋白到动粒:通过Shugoshin保护姐妹染色单体的Cohesion,防止姐妹染色单体过早分离。近年来,SAC在染色体分离中的作用对于阐明胚胎染色体异常以及在肿瘤生成中的作用成为细胞生物学研究的热点,但SAC在人类早期胚胎发育及染色体异常中的作用

6、鲜见报道。本研究采用FISH技术,选用13、16、18、2l、22、X、Y染色体特异性探针,检测自然流产胚胎染色体数目是否异常,将自然流产胚胎分为染色体数目正常组和异常组,应用RT-PCR和Westem-blot方法检测自然流产胚胎组织^纠D2、BUBlmRNA及其蛋白的表达,探讨其在人类胚胎染色体分离中的作用。目的通过检测删、BUBImRNA及其蛋白在自然流产胚胎染色体数目正常组、异常组中的表达,探讨其在人类胚胎染色体分离中的作用。材料与方法1研究对象病例来源于郑州大学第三附属医院妇产科2010

7、年6月至2011年1月因先兆流产或超声发现胚胎停育而就诊的99例自然流产患者,应用FISH技术将其分为染色体数目异常组和正常组。2实验方法Tl摘要2.1标本采集与处理清宫术后挑取绒毛组织,部分组织按照FISH检测要求进行标本处理,其余绒毛组织迅速冷冻后置.80℃冰箱用于RT-PCR和Western.blot检测。该实验经郑卅I大学第三附属医院伦理委员会批准,留取标本时,均征求患者同意并签署知情同意书。2.2FISH检测自然流产胚胎绒毛组织染色体数目2.2.1标本处理无菌挑选自然流产胚胎新鲜绒毛组织

8、5一lOmg,生理盐水冲净血液和粘液,眼科剪剪碎后低渗,固定,冰醋酸消化,离心后弃上清液,滴片。2.2.2FISH检测滴好的标本片经胃蛋白酶消化后置74.5℃变性液5mill,.20℃预冷乙醇梯度脱水,将lO山探针加于标本片杂交区域,封片后置湿盒42"C恒温培养箱中杂交过夜。暗室中将标本片依次置预热的50%甲酰胺/2xSSC溶液、2xSSC溶液、0.I%NP.40/2xSSC溶液中漂洗,经70%乙醇脱水,自然干燥后滴加10mDAPI复染剂,荧光显微镜下观察结果。2.3RT-PCR检

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