enos 基因转染对老鼠小体积肝移植缺血灌注损伤保护作用实验研究

《enos 基因转染对老鼠小体积肝移植缺血灌注损伤保护作用实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、eNOS基因转染对老鼠小体积肝移植缺血灌注损伤保护作用实验研究第一部分eNOS重组腺病毒载体的制备材料和方法1.1试剂：重组腺病毒载体Ad-eNOS(由上海第二军医大学惠赠)，HEK细胞株293(美国ATCC)，琼脂糖(Sigma公司)，DMEM培养基、胎牛血清(GIBCO公司)，PacI、Sa公司，TRIzol试剂盒（Gibco公司）。1.2实验仪器：生化培养箱（广东医疗器械厂），高速离心机（上海安亭科学仪器厂），XDS-1B倒置相差显微镜（重庆光电仪器有限公司），电热恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司），分析天平（上海

2、天平仪器厂），Real-time检测仪（BI公司）光学显微镜（重庆光电仪器有限公司厂），PCR仪（德国BIOMETRA公司），恒温振荡器（江苏太仓实验设备厂），EPS-300电泳仪（上海天能科技有限公司），微量加样器（德国GILSON公司），紫外分光光度计（德国EPPENDORF公司），电子天平（NAVIGATOR公司），CO2恒温培养箱（德国Hereaus公司），GIS-1000凝胶成像系统，450型自动酶标记数仪（美国百特公司），烤箱（德国Hereaus公司），XS2-D2倒置相差显徽镜（重庆光学仪器厂），电泳仪（比利时

3、Ultra-VioletProducts），-70℃低温冰箱（日本SANY0公司），19TE300倒置荧光显微镜（日本Nikon公司），垂直电泳槽（美国ContinentalLabProducts）。.二、实验方法根据GeneBankNM-181037(eNOS)的基因序列，设计并合成一对引物。GENE软件中的PCRPLAN程序，设置各参数：最适Tm=66，Tm允许范围5长度15-25，G-C含量40-60%，引物内互补最大值为3，3端G-C添加为模板其它位点同源最大值为60%。经过运算，获得较佳的引物序列。并由基因公司合成

4、。在培养皿中接种1.5106的HEK293细胞，37℃过夜培养，在生物安全柜中弃上清，加入4ml无血清的培养基室温放置l小时。取4ug重组腺病毒载体Ad-eNOS用Pacl单酶切线性化后，加入无血清培养基至250ul，混匀为A;将12ulLipo2000脂质体加入238ul无血清培养基中，混匀为B;室温5分钟后，将A缓慢加入B中，混匀，室温避光静置20分钟为C;移去培养皿中的培养基并加入上述脂质体和腺病毒的培养基混合物C，培养24h后，移去转染液，添加4ml含10%血清的培养基，混匀，培养。..第二部分eNOS基因转染对L0

5、2肝细胞缺复氧损伤的保护作用材料和方法从液氮罐中取出冻存的L02肝细胞迅速放入37℃温水中，摇动使其尽快解冻。细胞悬液并滴加5mL1640洗涤，混匀后离心（800～1000rpm，5min），弃上清夜，再以1640洗涤，离心，重复2～3次，接种于含灭活胎牛血清、RPMI-1640完全培养基中，置37℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱内培养。3-5天传代一次，细胞传代扩增3-5代，一部分细胞用于实验，剩余细胞冻存备用。L02肝细胞培养达1106个/ml时用完全培养基重新悬浮，并以1:3的比例传代，取对数生长期细胞，更换新鲜培养液后

6、，放入低氧环境（含95%N2+5%CO2、PO2≤4Kpa）孵箱中培养12小时；更换新鲜培养液后，再放入复氧环境（85%O2+15%CO2，PO2≥13Kpa）孵箱中培养12小时。采用硝酸还原酶法测定细胞培养液NO的含量。NO化学性质活泼，在体内很快转化为NO2和NO3，而N02又进一步转化为N02-，N02-又进一步转化为N03-,利用硝酸还原酶特异性将N03-还原为N02-，通过显色深浅测其浓度的高低。结果实验组细胞培养液中ALT含量(26.26±3.78u/l)明显低于对照组(48.42&pl

7、usmn;5.31u/l)（P﹤0.05）,但高于正常组(17.20±2.64u/l)，差别有显著意义（P﹤0.05）。(图2-1)肝脏缺血再灌注损伤常见于肝移植、肝叶切除时肝门血管阻断、休克复苏时等病理生理过程，可导致肝细胞坏死、炎细胞浸润和细胞凋亡等[1-4]。肝脏缺血再灌注损伤发生机制复杂，是许多因素的共同影响的结果，现认为主要与钙离子超载、氧自由基、肝枯否细胞释放细胞因子、血管内皮细胞释放内皮素和一氧化氮等因素有关，最后导致肝细胞坏死及肝功能损害[5]。NO是由血管内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等多种细

8、胞分泌的介质，它舒张血管、抑制血小板聚集、抑制白细胞与内皮细胞黏附。Li等[6]在大鼠肝缺血再灌注实验中应用合成NO的前体物质L-精氨酸，有效减轻了缺血再灌注损伤。认为可能L-精氨酸促进NO的合成，抑制了天冬半胱酶-3(caspase-3)诱导的肝细胞凋亡，减轻了缺血再灌注损伤。在肝缺血预