hhsp70基因冠脉转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

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1、hHSP70基因冠脉转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用Intra-coronaryTransfectionofhumanheatshock70geneprotectsthemyocardiumagainstischemia/reperfusioninjuryinrats中南大学湘雅二医院麻醉科郭亮徐军美3硕士学位论文中文摘要摘要目的：研究hHSP70基因经冠脉转染对大鼠心肌抗缺血再灌注损伤的效应，并探讨其可能机制。方法：（1）构建复制缺陷型重组腺病毒：采用分子克隆手段获得携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组质粒、携带人热休克蛋白70的重组质粒，以细胞

2、内同源重组法构建复制缺陷型重组腺病毒Adv-EGFP、Adv-hHsp70，在293细胞内分别扩增，应用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。经氯化铯纯化滴度分别为，Adv-EGFP：2.0×109Pfu/ml；Adv-Hsp70:2.5×1010Pfu/ml。（2）选择50只S-D大鼠随机分成7组（n=10）。大鼠左侧开胸，暴露心脏及升主动脉和肺动脉根部，用无损伤血管钳钳夹于主、肺动脉根部，阻断循环10秒钟，同时用27号针头于左心尖部注射各组相应试剂0.1ml至左心室腔，使之在密闭的冠脉循环内分布。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组仅注射0.1ml生理盐水；第Ⅳ、Ⅴ组分别注射含Adv-E

3、GFP、adv-Hhsp70（1×109pfu)的生理盐水；关胸苏醒后，稳定4天，使经冠脉转染的基因充分表达于心肌。（3）冠脉转染4天后，再次暴露胸腔，在动脉圆锥与左心耳根部间结扎冠状动脉左前降支(LAD)。结扎45min后,松开缝线使冠状动脉再通180min。Ⅰ组只穿线不结扎。Ⅲ组在LAD结扎5min后开放5min，并重复3次，然后再行45min缺血、180min再灌注。（4）采用Evan'sBlue和TTC双染色法后利用image-proVI硕士学位论文中文摘要plus5.0测定心肌梗死面积;光学显微镜下观察心肌的炎症改变；WesternBlotting免疫

4、印迹测定心肌基因表达的改变并利用bandscan4.5进行灰度测量进而统计计算。结果:（1）经缺血预处理或hHSP70转染后的心梗范围(27.13±2.7%，27.88±5.3%，)较缺血再灌注组和腺病毒对照组(39.72±4.2%，32.73±7.0%)明显缩小。hHSP70转染组与缺血预处理组没有统计学差别。（2）hHSP70过量表达能够增加Bcl-2表达及减少caspase-3活化态的生成进。（3）hHSP70过量表达能减少NF-κB的活化。（4）心肌表达的蛋白发生相应的变化，hHSP70转染组hHSP70过量表达，，Bcl-2表达增加，活化的caspas

5、e-3减少。结论：（1）hHSP70转染能通过HSP70的过表达，增加Bcl-2表达，减少caspase-3的活化及其他机制来抑制凋亡。（2）hHSP70转染能通过抑制NF-κB的表达及活化及其他机制起到抑制炎症作用。（3）在HSP70过表达的情况下对心肌梗死与缺血预处理组没有统计学差别，可以起到与缺血预处理急性期同等程度的心肌的保护作用。关键词缺血再灌注损伤，腺病毒载体，hHSP70，凋亡，炎症VI硕士学位论文英文摘要ABSTRACTObjectives：Toobservetheprotectiveeffectagainstmyocardialischemia

6、reperfusioninjuryaftertransferofhumanHSP70geneviacoronaryarteryandtoinvestigatethepotentialmechanisms.Methods：(1)Constructionofthereplication-deficientrecombinantadenovirus:RecombinantplasmidsPDC-EGFP(containingenhancedgreenfluorescenceproteinEGFPgene),PDC-hsp70(containinghumanHSPgen

7、e).RecombinantadenovirusAdv-EGFP,Adv-hsp70wereproducedbyhomologousrecombinantin293cells,amplifiedalsoin293cellsonalargescale,andpurifiedbyultracentrifugationinCsClstepgradientsolutions.TheconcentrationofrecombinantadenovirusAdv-EGFPpurifiedbyultracentrifugationinCsClstepgradientsolut

8、ionsis2.0×10