hhsp70基因冠脉转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤的

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1、hHSP70基因冠脉转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤的毕业【摘要】目的：研究hHSP70基因经冠脉转染对大鼠心肌抗缺血再灌注损伤的效应，并探讨其可能机制。方法：（1）构建复制缺陷型重组腺病毒：采用分子克隆手段获得携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组质粒、携带人热休克蛋白70的重组质粒，以细胞内同源重组法构建复制缺陷型重组腺病毒Adv-EGFP、Adv-hHsp70，在293细胞内分别扩增，应用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。经氯化铯纯化滴度分别为，Adv-EGFP：2.0×109Pfu/ml；Ad

2、v-Hsp70:2.5×1010Pfu/ml。（2）选择50只S-D大鼠随机分成7组（n=10）。大鼠左侧开胸，暴露心脏及升主动脉和肺动脉根部，用无损伤血管钳钳夹于主、肺动脉根部，阻断循环10秒钟，同时用27号针头于左心尖部注射各组相应试剂0.1ml至左心室腔，使之在密闭的冠脉循环内分布。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组仅注射0.1ml生理盐水；第Ⅳ、Ⅴ组分别注射含Adv-EGFP、adv-Hhsp70（1×109pfu)的生理盐水；关胸苏醒后，稳定4天，使经冠脉转染的基因充分表达于心肌。（3）冠脉转染4天后，再次暴

3、露胸腔，在动脉圆锥与左心耳根部间结扎冠状动脉左前降支(LAD)。结扎45min后,松开缝线使冠状动脉再通180min。Ⅰ组只穿线不结扎。Ⅲ组在LAD结扎5min后开放5min，并重复3次，然后再行45min缺血、180min再灌注。（4）采用Evan'sBlue和TTC双染色法后利用image-proplus5.0测定心肌梗死面积;光学显微镜下观察心肌的炎症改变；ethods：(1)Constructionofthereplication-deficientrebinantadenovirus:Re

4、binantplasmidsPDC-EGFP(containingenhancedgreenfluorescenceproteinEGFPgene),PDC-hsp70(containinghumanHSPgene).RebinantadenovirusAdv-EGFP,Adv-hsp70ologousrebinantin293cells,amplifiedalsoin293cellsonalargescale,andpurifiedbyultracentrifugationinCsClstepgr

5、adientsolutions.TheconcentrationofrebinantadenovirusAdv-EGFPpurifiedbyultracentrifugationinCsClstepgradientsolutionsis2.0×109Pfu/ml;thatofAdv-hsp70is2.5×1010Pfu/ml.(2)50S-Dratslydividedinto5groups(n=10).Theleftthoracotomyedandthepericardiumopenedonarya

6、rteryandascendingaorta.Pulmonaryarteryandascendingaortaaticvascularclamptoachievepletecessationofoutfloetimeadenovirusparticles(1.0×109pfu)in0.1mlof0.9%salinesolutionlsyringepoved.0.1mlsalinesolutionaloneyedtoexposetheanteriorsurfaceoftheheart.Theproxi

7、malleftanteriordescendingcoronaryartery(LAD)yocardium.RegionalleftventricularischemiainbyligationofLAD.Ischemiaedbydiscolorationofmyocardiumandbychangesincardiacrhythm.Attheendoftheischemiaperiod,theligationin.GroupⅠ(sham-operatedgroup)servedassurgical

8、controlsandesurgicalproceduresasthetheexperimentalgroup,icpreconditioning(IPC)beforeI/Rbyrepeatedischemiaandreperfusionthrough3cyclesofinducedLADischemiafor5minfolloinofreperfusion.(4)Toevaluatetheeffectof45minischemiafolloinreperfusion