转染livin对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响的论文

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1、转染Livin对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响的论文转染livin对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响【关键词】心肌梗死;缺血再灌注损伤;糖尿病;livin【摘要】目的观察转染livin对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注过程中livin、caspase3表达以及心肌细胞凋亡和心肌梗死范围的影响。方法健康sd大鼠80只，应用小剂量多次链脲佐菌素(stz)注射法建立2型糖尿病大鼠模型，随机选取60只大鼠分为假手术组、缺血再灌注(ir)组、空载体组和livin组。假手术组不结扎冠状动脉;livin组开胸心肌内注射表达livin的逆转录病毒载体，24h后行ir;

2、空载体组开胸注射空载体，24h后行ir。荧光定量pcr测定caspase3mrna，livinmrna表达，用ttc染色法测定梗死范围，tunel法测定凋亡心肌细胞。结果①荧光定量pcr检测到糖尿病大鼠心肌细胞有livin表达，空载体组及ir组livin表达均不增加;转染livin后大鼠心肌内livin表达明显增加(p<0.01)。②ir组caspase3表达明显增加，显著高于假手术组(p<0.01);与ir组相比，livin组caspase3mrna表达水平显著降低(p<0.01)。③livin组心肌梗死范围较ir组显著减少(

3、p<0.05)。④tunel法检测显示糖尿病大鼠ir过程中可见心肌细胞凋亡的发生，ir组较对照组显著增加(p<0.05);注射livin后则细胞凋亡的发生明显减少，与ir组比较差异显著(p<0.05)。.结论心肌livin过表达可以抑制糖尿病大鼠心肌caspase3表达，抑制ir过程中心肌细胞凋亡的发生，缩小心肌梗死范围。【关键词】心肌梗死;缺血再灌注损伤;糖尿病;livin　糖尿病是冠心病独立危险因素，心肌细胞凋亡是引发糖尿病缺血性心脏疾病发生与发展的主要因素。急性心肌梗死(ami)合并糖尿病人群的死亡率也高于非糖尿病人群。ami

4、后再灌注治疗可造成心肌缺血再灌注损伤(iri)细胞凋亡与心肌iri有关，如能抑制心肌细胞凋亡，则可以保护缺血心肌。caspase3是细胞凋亡调控的重要因子，livin是近年发现的凋亡抑制蛋白家族(iaps)的新成员，本研究拟转染表达livin的逆转录病毒载体对糖尿病大鼠心肌iri的影响及其机制，为临床治疗iri提供新的思路。　　1资料与方法　　1.1实验材料　　工具酶及禽源性逆转录酶amv购于promega公司;markerdl2000购自takara公司;rna提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自qiagen公司;胎牛血清购自hycl

5、one公司，链脲佐菌素(stz)、氯化三苯基四氮唑(ttc)和伊文氏蓝均购自sigma公司，fugene6(transfectionreagent)转染试剂盒及细胞凋亡原位检测(tunel)试剂盒购于roche公司。表达livin的逆转录病毒载体由郑州大学基础医学院赵国强教授提供。　　1.2动物模型的建立　　sd大鼠80只，体质量(250±50)g，由河南省实验动物中心提供，以高脂高糖饲料喂养(其中含10%蔗糖，10%猪油，5%胆固醇)，4g/kg。继续高糖高脂饲料喂养，于注射后1、2个月测定体重和血糖。选择非空腹血糖16.7～25.6mmol/l的大

6、鼠作为造模成功的糖尿病大鼠。经检测模型成功大鼠共66只，随机选取其中60只大鼠,并分为缺血再灌注(ir)组，空载体组，livin组和假手术组，每组15只。ir组结扎左冠状动脉前降支(lad)，以结扎后心电图ⅱ导联st段抬高，相关缺血区域变苍白为成功。30min后松开结扎线再灌注120min，处死动物。livin组先开胸于lad结扎线上方注射livin载体50μl(3.9×107/ml)，空载体组注射空载体50μl,24h后行ir过程。假手术组动物模型建立方法同上，在冠状动脉下穿线但不结扎。　　1.3实时荧光定量pcr检测　　caspase3及livin

7、mrna按trizol试剂盒提取鼠损伤区心肌组织总rna,以引物设计软件(oligo)六聚体为引物，以提取的总rna为模板，在amv催化下反转录出cdna。反转录体系如下：amv酶1μl，5×缓冲液6μl，rnasin1μl，2.5mmol/l核苷酸dntps2μl，rna5μl，10μmol/l随机引物1μl，加depc处理水至总体积30μl，42℃水浴1h。各引物序列及扩增片段如下：livin：上游5′atggggcctgagagtagggccag3′，下游5′gacagaggccgaagctggcc3′，169bp;caspase3上游5′gt

8、cgatgcagctaacctcag3′，下游5′gacttagaatcacacacac3′，