大鼠肝癌肺转移灶中边缘群细胞的分离与鉴定

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1、第四军医大学硕士学位论文5%CO2孵箱中培养，每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，计数克隆数目；重复5次，计算平均克隆数目，Studentt检验比较SP细胞和non-SP细胞平均克隆数目。7自我增殖实验将分选得到的SP细胞和non-SP细胞分别在无血清培养基中培养2周后，再次予以Hoechst33342染色后，分析两组细胞中边缘群细胞的含量。8Transwell侵袭实验在细胞培养板中制备Martrigel胶，将肺转移肝癌SP细胞、non-SP细胞、未分选肺转移肝癌细胞分别加入含培养液及趋化因子的该培养板中，37℃条件下培养

2、12小后，镜下观察计算平均穿膜细胞数。细胞侵袭试验中获得的穿膜细胞数数据用x±s表示，应用SPSS10.0软件进行ANOVA分析。9体内成瘤实验将分选得到的SP肝癌肺转移细胞和non-SP肝癌肺转移细胞用无菌技术接种至裸鼠右侧背部皮下，每组各10只裸鼠，每只裸鼠的接种细胞总数经流式细胞仪计数分选均为2×104个，每隔3天观察皮下肿瘤的生长情况，一周后处死裸鼠,称量皮下肿瘤重量及体积。结果1大鼠肝癌晚期出现肺转移对照组大鼠生长情况良好，病理解剖各组织器官未见异常；实验组大鼠处死后解剖发现：肝脏均出现不同程度的肝硬化，肝脏表面

3、满布癌结节，其中2只大鼠双肺表面可见粟粒样转移性癌结节，部分肺组织经固定包埋切片后，行H.E染色镜检证实为肝癌肺转移灶。2肺转移灶肝癌细胞体外培养的镜下观察组织块接种至培养瓶24小时后，可见组织块边缘有大量细胞释放；在后续培养中陆续可见到大量细胞从组织块中释放、贴壁、伸展成上皮样细胞，培养7天去除组织块后，在原植块位置可见到明显的上皮样细胞岛形成。3肺转移性肝癌SP细胞的分离细胞经Hoechst33342染色后在流式-5-第四军医大学硕士学位论文细胞仪上检测的结果：以Hoechstred为X轴、Hoechstblue为Y轴

4、所作的二维散点图中，在远离肝癌细胞集中区域的左下角部分，可见到一小部分光点聚集，它们表现为低Hoechstblue和低Hoechstred的特征，与其它绝大多数肝癌细胞的散射荧光特征明显不同，该群位于边缘的“特殊”细胞即“边缘群细胞”(SP细胞)。4肺转移性肝癌SP细胞高表达干细胞标志物SP细胞表面c-kit表达率为85%，Sca-1表达率为75%，而non-SP细胞表面c-kit及Sca-1表达率分别仅为8%和3%。5具有SP和non-SP表型的肺转移肝癌细胞在体外无血清培养基中的培养SP表型的肺转移肝癌细胞在无血清培养

5、基中仍保持有增殖的能力，而non-SP细胞组未观察到明显的增殖现象;培养10天后，倒置显微镜下观察发现SP表型的肝癌细胞在无血清培养基中形成了多个岛屿样的细胞克隆;而non-SP肝癌细胞组此时仍未见有显著的增殖，倒置显微镜下观察发现有未贴壁的死亡细胞。6肺转移肝癌SP细胞软琼脂克隆形成能力高于non-SP细胞SP肺转移肝癌细胞在软琼脂培养基中培养3周后，大部分细胞形成了明显的细胞克隆，细胞克隆呈桑椹样，每个克隆由16-20个细胞组成，细胞呈透亮的球形，平均克隆形成率达到了69.90%；而non-SP表型的肺转移肝癌细胞在软

6、琼脂培养基中未能形成明显的细胞克隆，大部分细胞趋于凋亡、崩解，该组细胞的平均克隆形成率仅为15.25%。t=20.46，n=5，P<0.01。7自我增殖实验将上述SP细胞和non-SP细胞用Hoechst33342染色并经流式细胞仪检测后，SP细胞组仍能检测到特征性的SP细胞群，而非SP肝癌细胞组在体外无血清条件下培养后，不仅无法再检测到特征性的SP细胞群,且在流式细胞检测中出现了明显的死亡细胞群。8Transwell侵袭实验肺转移肝癌SP细胞侵袭穿膜细胞数目均明显高于non-SP细胞及未分选细胞，显示肝癌肺转移SP细胞体

7、外侵袭能力强于-6-第四军医大学硕士学位论文non-SP细胞及未分选细胞。F=9.519481，P=0.002142。9裸鼠体内成瘤实验肿瘤细胞种植一个月后，SP细胞种植组裸鼠成瘤率，瘤体重量及体积明显高于non-SP细胞种植组。SP细胞体内成瘤能力明显高于non-SP细胞。结论来源于肝癌肺转移肿瘤组织的SP肝癌细胞群中富含具有干细胞特征的“特殊”细胞，这些“特殊”的细胞既具有形成和重建肝癌组织的能力，也具有较强侵袭转移能力，还通过自我增殖保持自我更新，它们在肝癌肺转移组织中发挥了类似正常组织中干细胞的角色和作用。肝癌肺转

8、移组织可能具有较强的异质性，其中包含肝癌干细胞和非干细胞，利用Hoechst33342染色结合流式细胞术分选的方法可得到具备肝癌干细胞特征的SP细胞，SP细胞相对于肝癌肺转移组织中的non-SP细胞具备较强的自我增殖能力、侵袭转移能力以及成瘤能力，肝癌SP细胞可能直接参与了肝癌的转移及复发。关键词肝癌转