原代大鼠边缘群肝细胞的分离及端粒酶活性分析论文

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1、原代大鼠边缘群肝细胞的分离及端粒酶活性分析论文刘海亮窦科峰李韧李霄张福琴【摘要】目的：通过检测端粒酶活性（TMA）在原代大鼠边缘群及非边缘群肝细胞中表达差异，探讨边缘群细胞是否具有肝脏干细胞的部分特征.方法：原位两步胶原酶法分离大鼠肝细胞.应用流式荧光激活细胞分选术(FACS)将肝细胞分成边缘群（SP）及非边缘群(NonSP)，并定量分析两群细胞中TMA水平.结果：存在SP细胞并占细胞总体2.1%，SP细胞TMA高于NonSP细胞（28.1±1.3vs2.0±0.2TPG，P0.01）.结论：大鼠边缘群肝细胞

2、具有更强的自我更新能力，即具有干细胞的部分特征.【关键词】肝细胞大鼠边缘群端粒酶干细胞0引言干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞.端粒酶活性在多数正常体细胞中不表达，而在胚胎细胞、造血干细胞、精原细胞中有表达.我们利用流式荧光激活细胞分选术(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)对原代大鼠肝细胞进行检测，试验是否也可以将正常大鼠肝细胞分成对荧光染料具有不同排出特性的边缘群(sidepopulation,SP)和非边缘群.freeleraseactivity,TMA)

3、的表达差异，以探索边缘群肝细胞是否具有更强的自我更新能力这一干细胞特性.1材料和方法1.1材料雄性SD大鼠(第四军医大学实验动物中心)、IV型胶原酶(Invirtrogen)、胎牛血清(杭州四季青)、HEPES、Hoechst33342(Sigma).TRAPezeXL端粒酶检测试剂盒(Chemicon).FACSAdvantageII型六色荧光流式细胞仪（BD公司）,BX51免疫荧光显微镜（Olympus公司）,PCR扩增仪(Eppendof公司),RF5000荧光分光光度计（日本岛津）,EPS2Z200垂

4、直电泳仪(Amersham)，其余试剂均为国产分析纯.1.2方法1.2.1大鼠肝细胞分离按Dunn等［1］法并略加改进.雄性SD大鼠5只，体质量180~200g，用20g/L戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，固定、消毒，股静脉注射肝素1000U，开腹显露门静脉后在距肝门1cm处插入22G套管针，连接蠕动泵，以30mL/min速率灌入4℃预冷的前灌注液(含0.2g/LEDTA,15mmol/LHEPES的HBSS)，剪开下腔静脉放出血液，10min后换为38℃预热的后灌注液（含5mmol/LCa2+,15m

5、mol/LHEPES,0.5g/LⅣ型胶原酶的HBSS），以15mL/min灌注10min.将肝脏取下放入12cm培养皿中，加入4℃的HBSS，冰上操作去除肝包膜，钝性撕裂肝组织.两层纱布过滤，将细胞悬液在4℃下50g离心3min，弃上清，重复洗涤2次.4g/L台盼蓝拒染法计算肝细胞存活率.将肝细胞沉淀重悬于含100mL/L胎牛血清、10nmol/L胰岛素、100nmol/L地塞米松、105U/L青霉素、100μg/L链霉素的培养液中，以1×108个/L密度接种3个25mL培养瓶，24h换液，计算肝细胞贴壁率.1

6、.2.2SP细胞及NonSP细胞的检测及分选①细胞染色：调整肝细胞悬液密度为1×109个/L.HBSS洗涤，制备成单细胞悬液.等分细胞悬液，两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6mg/L，其中一组再加入维拉帕米，终浓度5mmol/L.37℃避光水浴90min，冰上10min终止染色，冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬浮.再加入PI使终浓度为2mg/L.②流式细胞仪检测：355nmUV激发光源，610nm双色短通反射滤镜，450nm和675nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号

7、.测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以HoechstRed为X轴，HoechstBlue为Y轴作二维散点图，将低HoechstRed及低HoechstBlue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比.分选出SP细胞及NonSP细胞.1.2.3SP细胞及NonSP细胞端粒酶活性检测①细胞处理及PCR：取SP和NonSP细胞各105个，依照TRAPezeXL端粒酶检测试剂盒说明书进行细胞处理.PCR反应条件：30℃孵育30min，94℃30s,59℃30s,72℃1

8、min进行36个循环，72℃3min延伸，然后是55℃25min，终止于4℃.②荧光分光光度计检测及数据统计：设置荧光素的激发/发射波长为495nm/516nm，硫氰酸盐的激发/发射波长为600nm/620nm，分别记录每个样本在两种激发/发射波长下的荧光值，并根据试剂盒要求计算出每个样本的TMA值.③100mL/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：取20μLPCR产物在垂直电泳