转基因动物及克隆动物

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1、转基因动物及克隆动物TransgenicAnimalandClonalAnimal内容转基因动物克隆动物概述、方法、应用体细胞克隆第一部分转基因动物1974年Jaenisch等用病毒SV40转化的小鼠早期胚胎移植到小鼠的子宫内，在小鼠的后代中检测到SV40基因的存在，进行转基因技术尝试，这是最早有关动物转基因的报道。1980年，Gordon等首次采用受精卵原核显微注射法，首次将疱疹病毒和SV40的DNA片段导入小鼠基因组，成功制作转基因小鼠，开创了转基因动物的新纪元。一、研究概况1982年Palmit

2、er-“超级巨鼠”华盛顿大学的Palmiter将大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵内,培育出体型明显大于正常小鼠的超级鼠,成果轰动一时。转基因小鼠A生长速度要比普通小鼠B的生长速度平均快50%。1982年Palmiter“超级巨鼠”重组质粒鼠金属巯基蛋白启动子之后大鼠生长激素基因置于小Plonucleus（雄原核）显微注射小鼠子宫卵移植SOUTHERN杂交检测超级巨鼠1987年世界上第一只商业化转基因绵羊诞生(Roslin研究所)1989年精子载体法应用于转基因动物1997年转基因克隆动物(Rosl

3、in研究所)转基因克隆羊Polly:携带有人凝血因子Ⅸ1999年上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生三十几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域转基因鼠5只克隆出的转基因小猪Noel、Angel、Star、Joy和Mary。全球首只转基因猴“Andy”转基因鱼转基因试管牛“滔滔”英国1990－2000年科研中使用转基因动物的比例图三十年来，转基因动物经历了兴起——高潮——现在相对平

4、稳的过程。其重要意义在于人为实现动物物种之间，甚至动物与植物、微生物之间遗传物质的交换与重组。如：改变动物性状导入抗病基因二、转基因动物的概念转基因动物（Transgenicanimal）嵌合体动物（Chimericanimal）指染色体基因组中整合有外源基并能稳定遗传给后代的一类动物部分组织细胞中整合有外源基因组的动物三、转基因动物培育原理四、方法显微注射法逆转录病毒法ES（胚胎干细胞）法精子载体法脂质体载体法电脉冲法基因枪法体细胞核移植技术（转基因克隆技术）（一）显微注射法（以培育转基因小鼠为例

5、）1.方法显微注射制作转基因动物流程图2.具体步骤（1）前期准备实验动物：供体鼠、受体鼠、结扎雄鼠仪器设备：拉针仪、煅针仪、体视镜、显微注射仪实验试剂耗材：超排激素：PMSG、HCG、透明质酸酶（HE）、小鼠胚胎操作和培养液：M2、M16、注射用矿物油、注射针、持卵针显微注射仪拉针仪煅针仪体视镜（2）受精卵的采集供体鼠超排：PMSG,ipHCG,ip48hr输卵管膨大部受精卵的采集受精卵消化、洗涤、培养受精卵的采集受精卵的消化、培养消化、洗涤后受精卵原核清晰的受精卵注射前注射后（3）受精卵的显微注射注

6、射中（4）受精卵的移植受体假孕鼠的制备：母鼠与结扎公鼠合笼（与供体鼠同步）假孕鼠的挑选注射后收集卵的移植受精卵的移植（5）得到founder转基因小鼠（6）对founder转基因小鼠进行鉴定、筛选、杂交获得纯合转基因小鼠（二）逆转录病毒法关于逆转录病毒1、Retrovirus是只有一条单链RNA的病毒类的总称。2、逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作用下可以将本身的单链RNA作为模板进行复制和遗传信息的传递。3、逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。原理1、逆转录病毒

7、具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。2、逆转录病毒能作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。关键步骤（1）逆转录病毒载体的构建①提取病毒DNA②将DNA克隆载体中③酶切病毒结构蛋白编码区④将外源目的基因克隆到载体⑤转染细胞，测定外源基因的表达。（2）包装细胞决定着重组病毒效价及其宿主范围。常用φ-2细胞株（3）重组逆转录病毒感染早期胚胎载体转染包装细胞后与8细胞胚胎共培养进行转染（4）胚胎移植（5）建系（三）胚胎干细胞介导法（

8、ES细胞法）关于ES细胞1、胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）人或动物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干细胞，称胚胎干细胞。2、它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括生殖细胞在内的所有组织。原理将外源目的基因导入ES细胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎移植到假孕母鼠子宫内，便可获得由胚胎干细胞介导的转基因动物。关键步骤①ES细胞的分离培养②ES细胞基因操作电穿孔、显微注射