动物胚胎工程yyd转基因动物

《动物胚胎工程yyd转基因动物》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第九章转基因动物¾转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究中的突出成果。¾近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究等多方面做出了很大的贡献。（一）转基因动物的概念转基因动物（transgenicanimal）是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。¾外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代，这种动物叫转基因动物。¾严格说，转基因动物有别于嵌合体。¾嵌合体动物（chimericanimal）：只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因。逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的动物第一代均为嵌合体。雄原核显微

2、注射法制备的动物第一代中1-10%为嵌合体（延迟整合）。Gordon等人首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA顺序TGM。1982年Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物。从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。（二）转基因动物的制作方法1、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（ES细胞）法3、逆转录病毒感染法4、体细胞核移植法5、精子载

3、体法1、雄原核显微注射法以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。这一方法的实验程序如下：（1）准备假孕母鼠（养母）（2）受精卵的准备（3）基因导入（4）胚胎移植（5）对幼鼠的鉴定ExpressionofExogenousGenes筛选方法Southerns,Induction/LossofRestrictionsites,PCRRT-PCR测定表达产物活性：ELISA，RIA其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时间。基因的整合是随机的，多数插

4、入单一染色体位点中。外源基因的插入会引起宿主基因的DNA序列重排，缺失，重复或易位。外源基因也可不插入呈游离状态，以质粒形式存在表达功能并传给子代，其详细机理现在也不是很清楚。优点：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观；整合率高缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默2、胚胎干细胞（ES细胞）法ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包

5、括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。在ES细胞上的基因操作：可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。GeneratingESCellsScreeningESCellClonesScreeningPlate-GrowforDNA,restrictiondigest,thenSouthernPickclonesandtrypsinizeplateandgrowMasterPlate-

6、FreezecellsorcontinuetogrowandsubplateInjectionofEScellsintoblastocysts优点：外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。3、逆转录病毒感染法®利用逆转录病毒DNA的LTR区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，加入到动

7、物早期胚胎的培养液中，或与胚胎共培养，或微注入囊胚腔中，携带外源基因的逆转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。缺点：１．低拷贝数２．需要逆转录病毒３．插入DNA大小有限４．可能产生不希望的重组５．高频的镶嵌现象６．逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达4、体细胞核移植法®先将外源基因导入到供体细胞中，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，然后将这种细胞的细胞核导入一个去了核的未受精的成熟卵母细胞中融合并激活，将重构胚直接或进行