基于dna熔解曲线技术的金银花种质鉴定

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1、基于DNA熔解曲线技术的金银花种质鉴定　　[摘要]将高分辨率熔解曲线（highresolutionmeltingcurveanalysis，HRM）技术应用于金银花种质鉴定中，对已知7对SSR（简单重复序列，simplesequencerepeats）引物进行筛选，通过熔解曲线峰型及Tm差异，确定适合鉴别引物并考察其DNA模板浓度、退火温度及循环数的适宜范围。结合SIMCA-P软件对荧光信号进行处理分析，结果表明利用其中4对引物的熔解曲线可以区分金银花的3个主栽种质，为进一步完善金银花种质鉴定方法提供了依据。　　[关键词]高分辨率熔解曲线；金银花；种质鉴定　　[Abstract]To

2、establishanewhighresolutionmeltinganalyticalmethodforidentificationofLonicerajaponicagermplasm，thescreeningof7pairsofSSR（simplesequencerepeats）primers，determiningthesuitablediagnosticprimersbythedifferencesofpeakpatternandTmwasconducted.ThenintotheDNAtemplateconcentration，annealingtemperaturean

3、dthesuitablerangeofcyclenumberwereinvestigated.CombinedwithSIMCA-Psoftwarefordataprocessinganalysis，theresultsshowthatthreemaingermplasmhoneysucklecouldbedividedbyfoursetsofprimers.ItprovidesmethodologyforimprovingL.japonicagermplasmidentification.　　[Keywords]highresolutionmelting；LoniceraeJapo

4、nicaeFlos；germplasmidentification　　doi：10.4268/cjcmm20162415　　药材金银花的基原植物为忍冬属植物忍冬LonicerajaponicaThunb.，在长期的栽培过程中其形态发生了明显的变异和分化，形成了很多农家栽培品种或品系[1-2]。近年来，随着金银花价格走高，栽培面积扩大，新兴产区与传统产区间交互引种，致使出现同质异名或异质同名情况，限制了生产发展和种植效益的提高。由于不同种质金银花在植株形态、药材产量与质量等方面均表现出明显差异，因此建立合适的种质资源鉴定方法，对于金银花的种质资源评价、良种选育、规范种子种苗市场以及保障

5、药材品质均有重大意义。利用分子生物学技术进行种质资源分类与鉴定已取得重要进展，本课题组前期通过对金银花栽培种质进行调查与分类，表明7对SSR（简单重复序列，simplesequencerepeats）引物的指纹图谱可作为“分子身份证”区分全国58个金银花种质[3-4]，但该方法需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱进行检测，操作复杂、耗时长。　　为了建立准确、快速、可视化的主栽种质鉴定方法，本研究将高分辨率熔解曲线（highresolutionmeltingcurveanalysis，HRM）技术应用于金银花种质SSR鉴定中。高分辨率熔解曲?分析是在实时荧光定量PCR基础上发展起来的一项新技

6、术，其通过监测DNA双螺旋随温度升高时解链情况变化，具有简便、快速、高通量、对样本无污染等优点，在中药鉴定中显示出良好的应用前景[5]。使用HRM技术检测SSR标记，与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳分型相比，不需要PCR后续处等步骤，大大降低了检测时间并提高了灵敏度和特异性[6-7]。本研究使用HRM技术检测金银花种质的7对SSR鉴定标记，通过熔解曲线峰型及Tm差异，实现了金银花3个主栽种质的可视化鉴定，为金银花种质的栽培、流通、追溯监管及仲裁提供依据。　　1材料　　1.1仪器　　LightCycler480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪（Roche公司），DYY-12型电脑三恒多用电

7、泳仪（北京市六一仪器厂），5810R型低温冷冻离心（Eppendorf公司），MM400型混合型球磨仪（Retsch公司），数显恒温水浴锅（HH-2型，国华电器有限公司），紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene公司，型号GBOXHR）。　　1.2试剂　　改良2×CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取缓冲液，含有2%CTAB，100mmol?L-1Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷，pH8.0）、20mmol?L-1乙二胺四乙酸二钠（pH8.0）、2.5mol