基于dna分子标记的金银花掺伪鉴定方法研究

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2、ｉ扇基于DNA分子标记的金银花掺伪鉴定方法研究AdulterationIdentificationofLonicerajaponicabasedonDNAmolecularmarker学科专业：制药工程研究生：徐石勇指导教师：史清洪教授兰青阔副研究员天津大学化工学院学院二零一五年三月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的＾研究成果，除了文中特别加＾＾＞标注和致谢之处外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或

3、证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。口■＾学位论文作者签名：签字円期；广年ｒ月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津欠学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印。、缩印或扫描等复制手段保存、汇编Ｗ供查阅和借阅同意学校向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名剧币签名；

4、＂＇＾１＞｜：年月》日签字鬥期：年ｒ月签字円期摘要金银花为忍冬科植物忍冬（LonicerajaponicaThunb.）的干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒、凉散风热的功效，为常用的大宗中药材。近年来金银花的开发利用获得突破性进展，需求量急剧增大，市场缺口比较大。有些不法商家将价格便宜近十倍的山银花（LoniceraeFlos）当做金银花销售和使用。常用的金银花鉴定方法包括基于形态学标记的传统鉴定技术、基于药效成分的现代理化鉴定技术以及随机扩增多态性DNA技术（Randomamplifiedpolymorp

5、hicDNA，RAPD）和微卫星基础上的分子标记（inter-simplesequencerepeat，ISSR）等分子标记鉴定技术。但其鉴定技术的稳定性和准确性还不能完全满足现代中药材及中药品质量控制的要求。为保证临床疗效安全和消费者利益，亟需建立科学性强、精准的金银花掺伪鉴别方法。本文以大宗药材金银花为材料，基于EST-SSR、EST-SNP标记技术，结合高分辨率熔解曲线和焦磷酸测序分析技术，建立快速、高通量、自动化的金银花掺伪鉴别方法，为规范、监管药材市场提供技术支撑。主要研究结果如下：1、构建了基于E

6、xcel格式的金银花SSR指纹图谱，主要包括3对引物在6个供试材料中扩增到的18条多态性条带信息，应用该指纹图谱对金银花及其变种的遗传多样性进行分析，结果表明金银花与山银花之间遗传距离较远，仅为0.28。应用该指纹图谱对87个市售金银花样本进行分析，能够区分出河北、山东、河南等地的金银花品种。2、基于SNP标记技术，结合高分辨率熔解曲线分析技术，建立快速、高通量的金银花真伪检测方法。利用高分辨率溶解曲线技术对金银花和山银花的标志性SNP位点进行分析。该鉴别方法可用于金银花药材的真伪评价，在1-2h之内即可完成

7、金银花真伪的鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便和闭管检测防止污染等优势。3、基于SNP标记技术，结合焦磷酸测序分型分析技术，建立精准、高通量的金银花掺伪量检测方法。利用焦磷酸测序技术对金银花及其伪品山银花的标志性SNP位点进行定量分析，已达到获得中成药、保健品、食品中金银花成分掺伪结果。本发明的检测方法在3h之内即可完成金银花成分掺伪鉴定工作，具有简单易行、灵敏度高、快速、费用低和便于推广等特点，为现代中药掺伪鉴定开辟了广阔的前景。关键词：金银花；SSR标记；SNP标记；掺伪鉴定ABSTRACTLonice

8、rajaponicaThunbiswidelyusedintraditionalChinesemedicinesforitsheat-clearing,detoxifying,andanti-inflammatoryproperties,whichcomesfromL.hypoglaucaMiq.,L.confusa(Sweet)DC.,L.macranthoidesHand.-Mazz.,andL