中药材川贝母的dna分子标记鉴定研究

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1、中药材川贝母的DNA分子标记鉴定研究摘要：贝母为常用贵重中药材，药用历史悠久，我国贝母属槓物已超过50种（变种），全国各地用作贝母的原植物种类繁多，此外商品贝母中还常混有土贝母、唐菖蒲等伪品，严重影响了药品的安全性和有效性，由于贝母类药材的形态学上的差异较小，但是化学成分差异大，因此准确地鉴定贝母类药材的基源种类是一项极为重要的工作，为了探索贝母类药材的快速、准确的鉴别方法，运用分子标记技术鉴定川贝母的真伪，以克服目前仅依据形态、显微特征及理化进行鉴别的不足。关键词：川贝母；DNA；PCR【中图分类号】R284【文献标识码】B【文章编号】1672-8602（2014）03-019

2、6-01川贝母系百合科植物川贝母FritillariacirrhosaD.Don>暗紫贝母Friti1lariaunibracteataHsiaoetK.C.Hsia、甘肃贝母FritillariaprzewalskiiMaxim.、梭砂贝母FritillariadelavayiFranch.>太白贝母FritillariataipaiensisP・Y.Li或瓦布贝母FritillariaunibracteataHsiaoctK.C・Hsiavar・wabuensisCS.Y.TangctS.C.Yuc）Z・D・Liu.S・WangctS.C.Chen的干燥鳞茎。按性状不同分别习

3、称〃松贝〃、〃青贝〃、〃炉贝〃和〃栽培品〃。川贝母性微寒而味甘苦，入心肺经，能润肺、止咳、化痰，是一味珍贵的中药材。〃中国药典〃规定药用川贝母为以上6个晶种，但我国贝母属植物己超过50种，造成贝母基源极为复杂，并且随着需求量的增加，基源混乱的现象呈现不断增加的趋势，直接影响川贝母临床用药的安全、疗效。运用分子标记技术鉴定川贝母的真伪，以克服目前仅依据形态、显微特征及理化进行鉴别的不足。使屮药鉴定的手段从传统的形态表征扩展到了遗传物质DNAo特别是近年来微量DNA的PCR技术的应用发展，使分子生物学技术与方法以特异性强，稳定性好，微量、准确等特点，被广泛应用于近缘种、珍稀种、破碎药

4、材等的鉴定。本实验应用分子生物学技术对川贝母进行了研究，建立了川贝母DNA分子标记鉴定方法，为川贝母与其伪品的鉴定提供了科学依据。1材料与仪器1.1药材：（1）伊贝母对照药材、平贝母对照药材、湖北贝母对照药材、浙贝母对照药材、川贝母对照药材（中国药品生物制品检定所）。（2）青贝、炉贝、浓蜜贝母（广西锦莹药业有限公司）。1.2试药：新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）；10XPCR缓冲液、二氯化镁（25mmol/L）、dNTP（10mmol/L）.鉴别引物：5'CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3'和5'GCTACGTTCTTCATCGAT

5、3'、无菌超纯水、琼脂糖、50XTAE电泳缓冲液、DNA分子量标记物GM331（上海生工）；GclRcd核酸凝胶染色剂（BIOTIUM）；高保真TaqDAN聚合酶（5U/ul）、10X酶切缓冲液、SmaT（10U/ul）（Fermentas）o1.3仪器:H1850型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；K960型热循环仪（杭州晶格仪器有限公司）；DYCP-31DN型电泳仪（北京六一仪器厂）;GSG-2000核酸/蛋口质凝胶成像仪（珠海黑马医学仪器有限公司）o2方法2.1模板DNA提取:取本品0.lg,依次用75%乙醇51、灭菌超纯水lnil清洗，吸干表面水分，置乳钵

6、中研磨成极细粉。取20mg,置1.5ml离心管中，用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA［加入缓冲液API400卩1和RNA酶溶液（10mg/ml）4u1,涡漩振荡，65°C水浴加热10分钟，加入缓冲液AP2130u1,充分混匀，冰浴冷却5分钟，离心（转速为每分钟14000转）10分钟；吸取上清液转移入另一离心管中，加入1・5倍体积的缓冲液AP3/E,混匀，加到吸附柱上，离心（转速为每分钟13000转）1分钟，弃去过滤液，加入漂洗液700P1,离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤液；再加入漂洗液500ul,离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤液

7、；再离心（转速为每分钟13000转）2分钟，取出吸附柱，放入另一离心管中，加入50口1洗脱缓冲液，室温放置3〜5分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟,将洗脱液再加入吸附柱中,室温放置2分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟］,取洗脱液，作为供试品溶液，置4°C冰箱中备用。另取川贝母对照药材0.lg,同法制成对照药材模板DNA溶液。2.2PCR-RFLP反应：鉴别引物:5"CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3'和5'GCTACGTTCTTCATCGAT3