DNA熔解温度测定和改善芯片杂交差异的研究

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1、学校代码：10259学号：146061202密级：公开上海应用技术大学硕士学位论文题目：DNA熔解温度测定和改善芯片杂交差异的研究英文题目:StudyondeterminationofDNAmeltingtemperatureandimprovementofchiphybridizationdifference专业：应用化学学院：化学与环境工程学院研究方向：基因分析姓名：陈翔指导教师：朱滨副教授许旭教授二O一七年五月二十五日声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容外

2、，本论文不包含任何其他个人或集体已经公开发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学位论文保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。允许论文被查阅和借阅。本人授权上海应用技术大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。DNA熔解温度测定和改善芯片杂交差异的研究摘要核酸的熔解温度（Tm）值的准确测定

3、是分子生物学实验DNA杂交方法建立的基础，同时Tm值对基因芯片的研究亦有重要意义。本文提出DNA片段Tm值的荧光测定方法，较传统紫外法具有溶液需求量小，操作简便，抗干扰，可测2+定不同长短、不同GC%含量DNA片段的Tm值。利用Zn与甜菜碱的组合作用，在较低粘度条件下建立了使不同GC%含量DNA片段在同一条件下进行杂交的缓冲体系，并用基因芯片进行验证。优化了基因芯片的杂交条件，为实现基因芯片的高通量研究提供了一种方法。1.利用荧光实时定量PCR仪（RT-PCR），考察了荧光法测定不同GC%、不同长短DNA片段Tm值实验条件的影响。使用

4、的溶液条件为DNA溶液（终浓度10ng/μL）、SYBRGreenⅠ稀释液量1μL、磷酸盐溶液（终浓度5mmol/L）、Tris盐溶液（终浓度60mmol/L），总的实验体系为40μL。荧光定量RT-PCR仪测定程序为30℃30s，65个循环，每个循环加1℃。结果，测定不同GC%、不同长短DNA片段Tm值分别为lambdaDNA为87℃，不同GC%含量150~300bp（TPMT、CY、APOE）的Tm值为72℃、78℃、90℃，25bp的Oligo小片段（A、B、C）的Tm值为（43℃、67℃、>90℃）。相同实验条件下，紫外法测定

5、DNA片段的Tm分别为lambdaDNA为89℃、不同GC%含量150~300bp为70℃、79℃和>90℃。选择的荧光定量法实验条件可以准确测定不同GC%含量、不同长短DNA片段的Tm值，与紫外法测定的结果基本一致。2.建立了使不同GC%含量DNA片段在同一杂交温度、同一基因芯片上进行正确杂交的低粘度缓冲体系。在荧光法测定DNA片段熔解曲线的基础上，研2+究加入Zn和甜菜碱后不同GC%含量DNA片段解链温度的变化。根据解链温2+-4-2度变化，选择Zn浓度为10mol/L~10mol/L，甜菜碱的浓度1.5mol/L~2.5mol/

6、L，加入基因芯片杂交缓冲体系中，并在基因芯片上固定GC%含量为15%、50%和80%的20bp三种DNA探针以及相应有一个碱基突变的另外三种探针，突变探针的GC%含量分别为10%、55%和75%。选定杂交温度为31℃，用靶序列与基因-32+芯片进行杂交实验。结果，杂交体系中同时含有浓度为10mol/L的Zn离子和浓度为2.5mol/L的甜菜碱时，粘度较低，可以消除突变探针杂交非特异信号，特异性信号明显、均匀，达到了使不同GC%含量的DNA片段在同一张芯片、同一温度条件下进行准确杂交的预期目标。关键词：DNA熔解温度；荧光定量PCR；基

7、因芯片；甜菜碱；锌离子StudyondeterminationofDNAmeltingtemperatureandimprovementofchiphybridizationdifferenceAbstractTheaccuratedeterminationofTmvaluewasthebasisinmolecularbiologyexperimentandtheTmvaluewasveryimportantinstudyingofgenechip.Inthispaper,proposingamethoddeterminedTmval

8、ueofDNAfragmentbyRT-PCR,whichhadtheadvantagesofsmallamountofsolution,simpleoperation,anddeterminingtheTmvalueo