dna芯片原位合成和检测新技术的研究

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1、东南大学博士学位论文DNA芯片原位合成和检测新技术研究姓名：贺全国申请学位级别：博士专业：生物医学工程指导教师：陆祖宏20030101摘要DNA芯片技术作为一种高通量DNA分析检测方法，近年来备受关注。DNA芯片把大量已知序列探针集成在基片上，通过与标记的若干靶核酸序列杂交，可以对生物细胞或组织中大量的基因信息进行检测和分析。随着人类基因组计划的完成以及功能基因组研究的深入，要求对火量的基因信息进行高灵敏度、高特异性、定量化的检测。这对DNA芯片技术提出了挑战，同时也为DNA芯片技术的发展提供了机遇。寡核苷酸芯片的原位合成是制各高密度和高特异性DNA芯片的重要途径，是DNA芯片技术的重要发展方

2、向。由丁DNA芯片的原位合成条件苛刻、技术复杂、试剂成本高，国际上开展DNA芯片原位合成研究的单t

3、7=很少。目前仅有美国Affymetrix公司生产高密度基因芯片，该公司应用的光脱保护DNA芯片原位合成技术仍存在制各成本高、单步合成产率较低等问题，尚有待于完善。另一方面，发展高敏度的标记技术也还是DNA芯片技术的一个重要方向。但目前的研究主要集中在提高标记的效率和提高检测的灵敏度方面，而在降低芯片基底背景信号方面的考虑似乎不多。为此，本文提出，{：实现了软光刻技术制备DN脐片的新方法。软光刻技术制备DNA芯片的原位合成方法通过一套高精度定位压印系统，以聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章为图案转移

4、模板将DNA合成试剂多次压印定点分配在基片上，从而实现多层组合原位台成寡核苷酸探针序列一目ODNA芯片的制各。该方法具有操作简单、成本低、单步合成产率高等特点。同时，本文提出并发展了～种时间分辨荧光标记的新型DNA芯片检测技术。时间分辨荧光标记的稀七探针较之传统荧光探针，具有荧光寿命长，斯托克位移大，不受背景干扰的优点。通过时间分辨检测技术，可以把被标记的荧光信号从基底的荧光背景中分离出来，实现在各种基底(如玻璃、硅胶、聚合膜材料等)上的DNA芯片均相或非均相时间分辨荧光检测与分析。本文的工作主要集中丁‘研究采用软光刻技术制备DNA芯片的方法和工艺，以及发展一种时间分辨荧光标记的新型DNA芯片

5、检测技术两个方面。本文对软光刻技术制祭DNA芯片中的若干问题进行了深入的研究，特别是在软光刻技术的关键工艺——高质量大面积分子印章的制各方面进行了大量的创新研究。主要研究结果包括如下几个方面：lPDMs印章是软光刻技术幽案转移的关键，其变形与扭曲将直接影响多层定位与寡核苷酸序列组台合成。本文提出了一种对分子印章的角度扭曲进行定量评价的新方法，对平面PDMS印章阵点变形手f{曲进行了定窟分析。这种方法适用于评价各种相同或互补图案之问的乎面变形扭曲：绝对角度丰抖曲(81)与相对角度扭曲(02)。提出了改善了PDMS叩章与坡璃基底的科，和性能的分J二印章制备新J一艺，即对分子印章的玻璃板基板上进行砖

6、烷修饰。蚰f究发现：采_L}』硅烷修饰的玻璃扳墓扳制各的PDMS分子印章不仅馥善了PDMS印章的粘年¨性能，而且可以有效控制人面积PDMS印章的收缩与扭曲变形。当PDMS印章阵点高度为5．0X10m，其膜厚为1．0X10。3Ill时．硅烷化修饰基板的印章绝对角度扭曲0I小于3．98X10，相对角度扭曲02小丁1．22x10，完全能够满足软光刻技术制备DNA芯片时微米级多层次准确定位的要求。2．提出并实现了将所有多层PDMS印章集成在同一固相平面的大面积PDMS印章的思路．解决了不同印章与合成基片之间压印合成反应的准确定位问题；提出了用表面镀铝(银)玻璃板作印章母板的方法，解决了大面积PDMS印

7、章和其母板之间的脱模问题，确保了PDMS印章高保真地复制出模板的图案，此时印章线收缩小于0．043％，阵点面收缩小于0．3％；据此制备出高质量、高分辨、集成化的PDMS大面积弹性体PDMS印章，利用上述方法在一块0．18m×0．26m玻璃板上制备出168个PDMS印章，为分子印章法用于高密度DNA芯片技术的实用化奠定了重要的基础。3．亲水性PDMS印章的制备是软光刻技术制各DNA芯片的关键。文献上报道的采用氧等离子的PDMS表面处理会破坏印章上的微结构与形貌，从而难以实现软光刻技术合成DNA的微阵列所要求的大面积多次压印图型保型转移。本文提出了一种非损伤性的适用于大面积PDMS印章表面改性的方

8、法。该方法采用氩氢混合气体等离子的预处理PDMS表面后，藉用丙烯腈的接枝聚合对其表面进行亲水改性，实现了氰基朝外的定向接枝。经改性屙的PDMS表面，对乙腈接触角为17±7。，保证了对乙腈为溶剂的DNA合成试剂的良好浸润铺展和图案转移，弗能完好地保证原始的微结构与型貌。实验表明：丙烯腈接枝后的PDMS印章表面具有对反应极性溶剂的良好的相容性以及对转移和压印反应试剂的化学惰性。4．构建了软光刻技术制备