冬虫夏草pcr快速检测试剂盒的研制与效果评价

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1、冬虫夏草PCR快速检测试剂盒的研制与效果评价　　[摘要]冬虫夏草为我国传统名贵中药材。资源短缺、价格昂贵和巨大的市场需求导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象严重，亟需建立快速有效的鉴别方法。该研究基于实验前期已建立的冬虫夏草快速鉴定SSPCR方法，按照体外诊断试剂评价标准开发试剂盒，并对试剂盒的特异性、检测限、重复性及保存期4项性能进行了评价。结果显示冬虫夏草质量占混合物质量的1/200（质量分数05%以上）以上时可被成功检测。试剂盒对冬虫夏草及其伪品的检测结果显示，仅有冬虫夏草可被成功扩增，并在紫外下显示绿色荧光。该试剂盒37℃温育7d仍有效，说明4℃保存其在1年内稳定有效

2、。同一批次试剂盒在不同条件下，不同批次试剂盒在相同条件下，其检测结果均一致且准确，表明试剂盒具有良好的批内及批间重复性。将该试剂盒用于市售冬虫夏草及其混伪品的检测，操作简单快速，结果准确可靠，为下一步中药快检试剂盒的商品化奠定了基础。　　[关键词]冬虫夏草；聚合酶链式反应（PCR）；检测试剂盒Developmentandevaluationof　　[Abstract]OphiocordycepssinensisisavaluabletraditionalChinesemedicine.Duetoresourceshortage，expensivepriceandhug

3、emarketdemand，therearemanyadulterantsofO.sinensisinmarkets.Therefore，itisnecessarytoestablisharapidandeffectivemethodfordistinguishingO.sinensis.BasedonthespeciesspecificPCRofO.sinensis，thisstudydevelopedadetectionkitbyoptimizingthecomponentsandevaluatedthespecificity，detectionlimit，rep

4、eatabilityandshelflifeofthekit.TheresultsshowedthatwhenthequalityofO.sinensisaccountedformorethan1/200ofthatmixture，itcouldbedetectedsuccessfully.Moreover，onlyO.sinensiscouldbeamplifiedandglowedbrightgreenfluorescenceunderultravioletlight.Thekitwasstillineffectwhenitwasplacedat37℃forthr

5、eedays，whichindicatedthatitwasstableandeffectiveforoneyearstoredin4℃.Thekitinthesamebatchunderdifferentoperationconditions，andindifferentbatchunderthesameoperationconditionsgavethesameresultandaccuracy，whichshowedgoodrepeatabilityofthekit.Itissimple，rapidandaccuratetodistinguishO.sinens

6、isfromitsadulterantsusingthekit，andlaysthefoundationforcommercializationoftraditionalChinesemedicinefastdetectionkit.　　[Keywords]Ophiocordycepssinensis；PCR；detectionkit　　冬虫夏草是麦角菌科真菌冬虫夏草菌Ophiocordycepssinensis寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体[1]，具有补肾益肺，止血化痰的功效，临床用于治疗肾虚精亏，久咳虚喘等症，为我国传统名贵中药材。由于野生?

7、Y源有限且受到过度采挖，规模化的人工培育也尚未实现，导致冬虫夏草价格昂贵。巨大的市场需求也导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象严重，亟需建立快速有效的鉴别方法。现有的冬虫夏草真伪鉴别方法包括性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别和DNA条形码技术[2]等。形状鉴别主要通过观察冬虫夏草虫体和子座的颜色、大小、足的数目、气味等[36]。显微鉴别主要观察虫体中央的结构、躯壳表皮有无着生绒毛、躯壳内有无菌丝、子座横、纵切面、子囊壳的包埋位置、子囊壳及子囊孢子形态、大小等[35，7]。理化鉴别包括：紫外吸收光谱法[8]、红外光谱法[9]、薄层色谱法[10]、毛细管电泳法[11]