荧光pcr快速检测试剂盒

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1、荧光PCR快速检测试剂盒主要内容基础理论部分实验操作部分注意事项及其他基础理论部分基础知识PCR原理与过程PCR体系荧光PCRPCR基础1869年，核酸的概念Miescher从细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物…(DNA、RNA)1944年，核酸是遗传物质从S型肺炎球菌中提取的DNA与R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌转化S型菌，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先用DNA酶降解，就不发生转化1953年，DNA双螺旋结构冈崎片段DNA的半保留复制1971年，Khorana提出体外扩增设想1985年，Mullis发明PCR耐热聚合酶PCR基础Mullis发明PCR聚合酶链

2、式反应（polymerasechainreaction,PCR）实质：体外模拟DNA的复制过程由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成变性：打开DNA螺旋双链复性：引物与模板结合合成：Taq酶沿模板延伸PCR的原理①模板DNA双链的打开（变性）：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，双链解离成为单链，便于与引物结合②模板DNA与引物的退火(复性)：当温度降至55℃左右，单链模板DNA可与引物配对结合③引物引导下新链的合成（延伸）：DNA模板--引物复合体在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则合成一条新链Cycle1Cycle2Cycle3

3、动画：PCR原理.swfPCR课件.swfPCR原理①变性温度一般92oC-94oC,再高会缩短Taq酶半衰期使用薄壁均匀离心管时间取决于模板的复杂程度，前期一般1~5min。GC%、空间结构、杂蛋白等循环中变性一般15~60sec。对于模板没有纯化而扩增效果不好的，考虑延长变性时间注：热变性对DNA有重大的损伤，因此有时候变性时间长反而产物量会减少。PCR原理②退火因为引物>>模板，所以引物与模板配对的复性动力学系数远比模板复原的要大温度37oC-65oC甚至72oC（两步法）都有，视引物与模板的同源程度而定，一般使用比Tm值少5oC~10oC。如果引物与模板不是严紧配对

4、，一个碱基错配约降低Tm5oC。Tm计算经验公式：Tm=2（A+T）+4（G+C）时间15~60sec。PCR原理③延伸温度一般在72oC，因为是Taq酶反应最佳温度时间按扩增区段（目标产物大小）而定，一般15~60sec足够。72oC时合成速度>1000bp/minTaq酶在70oC合成速度为60nt/sec在55oC合成速度为24nt/sec在37oC合成速度为1.5nt/sec在22oC合成速度为0.25nt/sec含有酶的反应液操作最好在冰上进行PCR反应体系纯水（补够体积，使缓冲液为使用终浓度）10×反应缓冲液（酶的作用环境）dNTP引物模板Taq酶探针（荧光

5、PCR）PCR反应体系反应缓冲液对于不同的模板引物，最佳缓冲条件有待摸索。常用50mmol/LKCl、10mmol/LTris-HCl(pH8.3)、1.5mmol/LMgCl2。Tris-HCl在反应中pH会有变化，△pKa为-0.021/oC50mmol/L内的KCl有利于退火，高可能会抑制酶活有些反应使用NH4+代替K+(16mmol/L)PCR反应体系反应缓冲液Mg2+浓度影响引物退火和酶的活性，高Mg2+增强复性，也增加非特异性，降低模板变性温度。Mg2+浓度>dNTP+模板+EDTA浓度据报道，自由Mg2+浓度在0.7~0.8mM之间为好。有报道使用Mn2+代替Mg

6、2+，但是会增加突变dNTP应等浓度配置PCR反应体系反应缓冲液中可加一些PCR促进剂明胶TritonX-100稳定酶的活性BSADTT甘油DMSO降低解链温度，提高反应特异性甲酰胺TMAC(氯化四甲基铵)gp32(T4噬菌体基因32蛋白)甜菜碱PCR反应体系dNTP组成核酸长链的一个个小单元dATP，dGTP，dCTP，dTTP，dUTP…引物一小段单链DNA在Taq酶的作用下用于引导链的合成UNG酶在PCR产物或引物中用dU代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UNG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而

7、失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。引物设计引物设计的目标是在扩增的特异性和扩增效率之间取得平衡①引物长度：15-30nt。引物越短，引物与靶DNA结合速率越大，确保Tm>=55oC的最短引物可获得最好的效率和特异性，常用为18-24nt左右。如果扩增的序列具不均一性，引物长度应长些，28-35nt。长引物多用于扩增蛋白异构体或蛋白家族DNA；从不同物