食源性致病菌多重pcr检测试剂盒研制和应用

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1、山东农业大学硕士学位论文中文摘要近年来，食品安全事件频发，不仅影响到人们的生活、工作和健康，更是关系到国计民生的大事。在各种食物中毒中，细菌性食物中毒则是食物中毒的主要因素，常见的食源性致病菌包括沙门氏菌属、变形杆菌属、副溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、肉毒梭菌毒素、蜡样芽胞杆菌、韦氏梭菌、弯曲杆菌、李斯特菌、致病性大肠杆菌、结肠炎耶尔森氏菌、志贺氏菌属。本文针对在我国食物中毒中最常见的致病菌进行研究，寻求食物中毒诊断及食品检测的有效方法。本文涉及的食源性致病菌蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、沙门氏(Salmonella

2、spp)、大肠埃希氏菌0157:H7(E.coli-0157:H7)、志贺氏菌(Shigellaspp)、金黄色葡萄球菌（Sta.aureus）、单增李斯特氏杆菌（Listeriamonocytogenes）等菌属或菌。通过大量的文献参考和实验，我们经过筛选挑取种或属间特异的序列及相应引物，然后用这些引物对各种细菌的基因组序列进行PCR扩增检测其特异性，最终决定出用于检测的最优的目的基因及沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌溶血素hlyA基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶Nuc基因、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH、、大肠埃希O

3、157:H7的溶血素基因hlyAB、和致病性蜡样芽孢杆菌的溶血素hblA基因设计了6对特异性引物,建立两套三重PCR试剂盒，可同时实现对六种食源性致病菌的检测。试验过程中对多重PCR反应体系中引物添加量、镁离子浓度、dNTPmixture添加量及退火温度和循环数等影响要素进行优化，确定了适宜的多重PCR反应体系和扩增程序，即优化的三重PCR反应2+为：50uL反应体系中，dNTP终摩尔量为10pmol，Mg75pmol，5UTaq酶，hlyAB、ipaH和hblA终摩尔量分别为5pmol、5pmol和20pmol，invA、hly

4、A和nuc终摩尔量分别为7.5pmol、10pmol和10pmol，10×PCR反应缓冲液5uL；两套试剂盒共同的扩增条件为：预变性(94℃，5min)；28个循环：变性(94℃，30s)，退火(58℃，40s)延伸(72℃，70s);延伸:(72℃，12min)。对多重PCR扩增产物构建标准质粒，进行DNA测序，登录Genebank将测序结果进行网上blast，从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物，因此该多重PCR反应特异性较强。本方法通过人工污染肉及肉制品，同时检测六种食源性致病菌的灵敏度，O157:H7检出极限为19.8c

5、fu/mL，志贺氏菌检出极限可达17cfu/mL，蜡样芽孢杆菌检出极限为17.7cfu/mL。沙门氏菌检出极限为4.7cfu/mL，单核细胞增生李斯特菌检出极限可达171食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制与应用cfu/mL，金黄色葡萄球菌检出极限为4.5cfu/mL。应用建立的两套试剂盒，本研究对山东省泰安市及周边地区致病菌流行情况进行了调查监测，在各大农贸市场，家禽集散市场，屠宰市场，街道零售商处进行大批量采样检测，共取样502份，包括粪便、羽毛、屠宰冲刷水、屠宰器具、新鲜屠宰鸡只、冷冻鸡只。其中159样品检出沙门氏菌阳性，

6、感染率31.7%，56份样品检出蜡样芽胞杆菌阳性，感染率11.2%，45份样品检出O157阳性，感染率9.0%，26份检出单增李斯特菌阳性，感染率为5.2%，3份检出金黄色葡萄球菌阳性，感染率为0.6%，3份样品检出志贺氏菌阳性，感染率0.6%。将多重PCR方法结果与国家微生物标准检验法进行比较，符合率为为100%.结论:本研究建立的两套试剂盒可以同时检测上述6种病原菌，可用于食品及其原料的生物安全监测，也可用于兽医临床诊断。同时致病菌监测调查结果显示食源性致病菌在泰安地区禽肉市场的感染较为严重。负责处理加工程序的人员必须重新审查

7、生产过程中的关键控制点，以减少致病菌感染率。关键词：多重PCR试剂盒；食源性致病菌；大肠埃希O157：H7；单增李斯特菌；志贺氏菌；家禽屠宰市场；街道零售商2山东农业大学硕士学位论文AbstractTheproblemoffoodsafetyisbecomingmoreawaredandmoreseriousinmanycountries.It’sassociatedcloselywiththenationaldevelopmentandpeople’shealthandhappiness.Theimmediateandprope

8、rtreatmenttopatientswhohaveeatencontaminatedfoodisimportantaswellasthefoodsaftytestingbeforefoodaresoldoreatenbypeople.What’