《重组天冬酰胺酶分泌表达载体的构建》

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1、重组天冬酰胺酶分泌表达载体的构建目的要求1.了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。2.掌握以基因工程菌种6⑺///PANS2力材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组天冬酰胺酶II及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。实验方法&步骤一、表达制备方法：1.PCR扩増ansB基因:1).模板的制备用接种环挑取CPU210009菌体少许，在裂解液(1%TritonX-100,2mmol/LTris-HClpH8.5,2mmol/LEDTA)1ml中震散，95'C加热lOmin，吸取处理液5P1用于PCR。

2、引物：Tl：5Z-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGCACTTGC一3'12:5'-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG—3z流程图：菌体CPU210009①裂解液lml，震散②95°C加热吸取处理液5口1>PCR>ansB2.重组质粒pKK233-ansB的构建PCR扩增后的DNA八段及质粒pKK233-2同时分别川限制酶NeoI和HindIII消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的DNA片段和电泳回收的质粒大片段用T4DNA连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化HB101、71/18、ATCC9637、JM107

3、、CPU210009,筛选获得相应的阳性转化子。流程图:ansB基因NeoI►HindIIIpkk233-2载体限制性DNA人片段琼脂糖凝胶电泳分离与冋收T4DNA连接酶目的基因与质粒大片段►pkk233-ansB3.阳性转化子的筛选将涂布在含氨苄青霉素的LB平板上生长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB平板上，为每个克隆编号。平板置37°C温箱屮过夜，待菌落形成后，用灭菌牙签逐个挑取少量蘭体，移入预先加有0.1mol/L硼酸缓冲液(pH8.4)50u1的酶标板反应孔内，待菌体分散后，每孔各加入0.04mol/L天门冬酞胺底物溶液50ul，37°C保温15min,加奈氏试剂5

4、0Ul,呈深棕红色孔p、j对应的单幽落即为阳性转化子。流程图：挑入方格化的新鲜LB平板上，编号37°C温箱屮过夜转化菌落►挑収少量菌体加入酶标板反应孔内分散菌体菌落形成>►►50Ml0.04MAsn溶液/孔50U丨奈氏试剂/孔f——~r棕红色，阳性转化子>►

5、棕红色，阳性转化子37°C保温15min二、工程菌发酵培养(1)从平板上挑取菌种接种(阳性转化子)于新鲜的含氨苄青霉素(终浓度为lOOpg/nil)的LB液体培养基巾，37°C,摇床转速220r/min,培养至OD6W)*0.48〜0.6。(2〉摇瓶培养：再按2%接种:W:转接于发酵培养基(三角瓶20%装液量)屮，37°C,

6、250r/min，20h,12000r/min离心收集细胞。流程图：含Amp的LB液体培养37°C,摇床220r/min阳性转化子>►OD^oo0.48-0.62%接种量于发酵培养基①37°C,摇床250r/min,20ht，>>收集细胞②12000r/min离心三、重组L-天冬酰胺酶II分离纯化制备1.蔗糖溶液渗透振扰法和酶解法联用提取酶将发酵收获的菌体细胞悬浮于5倍体积的破壁液中，在30°C温和振荡70min后搅拌下倾入大量水中，4°C,边搅拌边加入lmol/LMnCl2(7.5%,V/V),沉淀核酸和菌体碎片，8000r/min,离心30min，收集上清液即得酶提取液。采用

7、Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-天冬酰胺酶II含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE屯泳分析。计算收率。2.硫酸铵分级沉淀在酶提取液中加入硫酸铵至55%饱和度，调pHSU7.0,冰水浴磁力搅拌60min,4°C静置过夜，12000r/min离心10min除去沉淀。再在上清液中加入硫酸铵至90%饱和度，调pH至等电点附近(约pH5.0),搅拌60min，4°C静置过夜，12000r/min离心10min，收集沉淀。采用Lowry法和Peterson修订法分别检测0的蛋白重组L-天冬酰胺酶II含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。1

8、.透析脱盐上述沉淀物用5nwl/L磷酸缓冲液(pH6.4)溶解，透析脱盐。1.DEAE-52阴离子交换柱层析DEAE-纤维素柱经5mnwl/L磷酸缓冲液(pH6.4)平衡后，上样品脱盐酶液，用相同缓冲液洗涤至蕪线平稳，改用50mmol/L磷酸缓冲液(pH6.4)洗脱，分部收集器收集，1.5ml/min，每管收集6ml,测定每管的A280伉和酶活性。绘制洗脱曲线。收集显示酶活性组分，冷冻干燥后即得高纯度的L-天冬酰胺酶冻干粉。流程图：搅拌加水»上清液(酶提取液)4°C静置过夜五倍体