体外连接法快速高效构建表达β半乳糖苷酶的重组腺病毒载体

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1、体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体作者：王家宁,王传成郭凌郧,黄永章[摘要]目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法:PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6kb的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SwaⅠ酶切，最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后，用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装

2、扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果:PCR扩增可见312bp特异性条带，PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切重组质粒后释放出4.6kbLacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法，本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础，Adeno-X-

3、LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。[关键词]体外连接;腺病毒;β－半乳糖苷酶;PI-SceⅠ;I-CeuⅠAbstract:ObjectiveToconstructrecombinantadenoviral13vectorexpressingβ-galactosidasebyinvitroligationandprovideabasisforconstructionofrecombinantadenovirusvectorexpressingtherapeuticgeneofinterest.MethodspShuttle2-

4、LacZwasdigestedwithPI-SceⅠ/I-CeuⅠand4.6KbfragmentofLacZgeneexpressioncassettewasrecovered.ThisfragmentwasligatedtopredigestedAdeno-XviralDNAwithPI-SceⅠ/I-CeuⅠ.TheligatedproductwasdigestedwithSwaⅠ.TheresultantDNAwastransformedintoE.Coli.DH5α.Thecorrectrecombinantplasmid,pAdeno-X

5、-LacZ,wasidentifiedbyPCRandPI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestion.ThePacI-digested,linearizedpAdeno-X-LacZwastransfectedintoAD293cellsbyLipofectamine.Recombinantadenovirus,Adeno-X-LacZ,waspurifiedwithCsCldensitygradientultracentrifugation.HVSMCwasinfectedwithAdeno-X-LacZ.X-galstainingwasperfo

6、rmedtomonitortheexpressionofβ-galactosidasegene.ResultsTherewasaspecificbandof312bpwhenpAdeno-X-LacZwasamplifiedbyPCR.PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestionofpAdeno-X-LacZreleased4.6KbofLacZgenefragment.X-galstainingconfirmedAdeno-X-LacZwaspackagedsuccessfullywithinAD293cellsandtheexpressiono

7、fβ-galactosidasegeneinHVSMC.ConclusionInvitroligationisasimple,rapidandefficientmethodforconstructingrecombinantadenoviralvector.Thisstudyprovides13abasisforconstructionofrecombinantadenoviralvectorcarryingtherapeuticgeneofinterest,Adeno-X-LacZisalsoausefulcontrolvectorforthere

8、searchofgenetransfermediatedbyrecombinantadenovirus.Ke