体外连接法快速高效构建表达β.doc

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1、体外连接法快速高效构建表达e作者：王家宁，王传成郭凌郧，黄永章［摘要］目的：采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ,为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法：PI_SceI/I~CeuI酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收kb的LacZ基因表迗盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SwaI酶切，最终产物转化DH5a。重组质粒用PCR法和PI-SceI/I_CeuI酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacI线性化后，用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl密度梯度

2、离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno_X_LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果:PCR扩增可见312bp特异性条带，PI-SceI/I-CeuI酶切重组质粒后释放出kbLacZ基因表达盒。X_gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表迗。结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法，本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础，Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体

3、。［关键词］体外连接;腺病毒；3—半乳糖苷酶；PI-SceI；I-CeuIAbstract：ObjectiveToconstructrecombinantT1T1euadenoviralvectorexpressingp-galactosidasebyinvitroligationandprovideabasisforconstructionofrecombinantadenovirusvectorexpressingtherapeuticgeneofpShuttle2-LacZwasdigestedwithPI-SceI/I~CeuTandKbfragme

4、ntofLacZgeneexpressioncassettewasrecovered.ThisfragmentwasligatedtopredigestedAdeno-XviralDNAwithPI-SceI/I~CeuI.TheligatedproductwasdigestedwithSwaI.TheresultantDNAwastransformedintoE.Coli.DH5a.Thecorrectrecombinantplasmid,pAdeno-X-LacZ,wasidentifiedbyPCRandPI-Scedigestion.ThePacI-

5、digested,linearizedpAdeno-X-LacZwastransfectedintoAD293cellsbyLipofectamine.Recombinantadenovirus,Adeno-X_LacZ,waspurifiedwithCsCldensitygradientultracentrifugation.HVSMCwasinfectedwithAdeno-X~LacZ.X-galstainingwasperformedtomonitortheexpressionof{3-galactosidasegene.ResultsTherewa

6、saspecificbandof312bpwhenpAdeno-X-LacZwasamplifiedbyPCR.PI-SeeI/I-CeuIdigestionofpAdeno-X-LacZreleasedofLacZgenefragment.X-galstainingconfirmedAdeno-X~LacZwaspackagedsuccessfullywithinAD293cellsandtheexpressionofP-galactosidasegeneinHVSMC.Conclusion!nvitroligationisasimple,rapidand

7、efficientmethodforconstructingrecombinantadenoviralvector.Thisstudyprovidesabasisforconstructionofrecombinantadenoviralvectorcarryingtherapeuticgeneofinterest,Adeno-X-LacZisalsoausefulcontrolvectorfortheresearchofgenetransfermediatedbyrecombinantadenovirus.Keywords：Invitroligation；

8、Adenovirus；P-galactosidase