体外连接法快速高效构建表达β

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1、体外连接法快速高效构建表达β作者：王家宁,王传成郭凌郧,黄永章[摘要]目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法:PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6kb的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SentofLacZgeneexpressioncassetteentedintoE.Coli.DH5α.Thecorrectrebinantplasmid,pAdeno-X-LacZ,ine.Rebinantadenov

2、irus,Adeno-X-LacZ,edtomonitortheexpressionofβ-galactosidasegene.ResultsThereplifiedbyPCR.PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestionofpAdeno-X-LacZreleased4.6KbofLacZgenefragment.X-galstainingconfirmedAdeno-X-LacZple,rapidandefficientmethodforconstructingrebinantadenoviralvector.Thisstudyprovidesabasisfo

3、rconstructionofrebinantadenoviralvectorcarryingtherapeuticgeneofinterest,Adeno-X-LacZisalsoausefulcontrolvectorfortheresearchofgenetransfermediatedbyrebinantadenovirus.Key（购自BDBiosciencesClontech公司）包括Adeno-XViralDNA(PI-SceⅠ/I-CeuⅠ已消化)，pShuttle2穿梭质粒（含有多克隆位点及PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切位点），pShuttle

4、2-LacZ,PI-SceⅠ和I-CeuⅠ内切酶，Adeno-X扩增引物(Forer:5’-TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGC-3’;Reverseprimer:5’-TCGACCATAGGGGATCGGGAGATC-3’)。X-gal（Sigma公司产品），Lipofectamine2000（Invitrogen公司产品），λDNA/HindⅢmarker(华美生物工程公司产品)，DH5α为本研究所保存，S（Promega公司产品）。AD293细胞（Stratagene公司）。1.2主要仪器高速冷冻离心机（Hettich,Universal32R

5、，德国），超速冷冻离心机（Hitach，CP80MX，日本），紫外/可见光分光光度计（Cecil，CE2041，英国），倒置相差显微镜（Nikon，TE2000-U，日本），二氧化碳培养箱（Binder，德国），超净工作台（苏净集团安泰公司），超低温冰箱（-80℃，Sanyo，日本），凝胶图像分析系统（Touching995geldocumentsystem，天呈科技公司）。1.3构建策略见图1。1.4携带LacZ基因的重组腺病毒质粒pAdeno-X-LacZ的构建pShuttle2-LacZ用PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切后进行低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收4.6

6、kb含LacZ基因的表达盒。将回收片段与预先用PI-SceⅠ/I-Ceu酶切的Adeno-XViralDNA采用快速连接体系连接。将连接产物用Sl）的LB平板上37℃倒置培养24h。挑选菌落扩增，采用碱裂解法小量抽提质粒，用PCR方法和PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切鉴定重组质粒是否携带有LacZ基因表达盒。若携带有LacZ基因表达盒的重组腺病毒质粒采用PCR扩增后则出现一特异性312bp片段，采用PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后会出现一4.6kb的片段。1.5Lipofectamine2000介导pAdeno-X-LacZ转染AD293细胞取20μgpAde

7、no-X-LacZ用Pac酶切37℃过夜，采用酚/氯仿抽提酶切片段，乙醇沉淀，高压三蒸水溶解，加50μlLipofectamine2000脂质体，室温30min，置4℃保存备用。AD293细胞培养于25cm2塑料培养瓶，待60％融合时，进行转染。弃培养液，用PBS洗1次，加4ml10％FCS.DMEM培养液，加入预先准备好的DNA/脂质体复合物至培养瓶中，每3d换培养液1次，观察细胞病变情况，至AD293细胞80％出现病变时收集细胞，37℃/-80℃反复冻融3次，12000g离心10min，收集上清。1.6重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定[14]取原代重组腺病毒上

8、清，反复感