体内和体外高效表达大肠杆菌水通道蛋白z

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1、浙江大学硕士学位论文摘要大肠杆菌水通道蛋白Z(AqpZ)水选择专一性强、渗透性高、结构稳定，所以AqpZ在仿生废水回收以及海水淡化等领域具有潜在的重要应用价值。但是由于AqpZ强烈疏水性会导致细胞毒性，使得在传统大肠杆菌体系表达量仅仅只有2．5mg／l，很难满足制备基于水通道蛋白的水过滤装置的需求。本工作的目的是运用融合表达策略和无细胞体系表达策略，高效制备功能性AqpZ，为制备新型水过滤装置奠定坚实的基础，并发展一个具有普遍意义的膜蛋白高效表达技术。首先采用融合表达策略，即在目标膜蛋白的上游引入亲水性分子伴侣，构建带有不

2、同融合标签的体内表达载体。发现pMAL．P2．AqpZ对宿主细胞生长的影响最小，融合蛋白的表达水平最高，进一步优化诱导条件(包括诱导时间、培养温度、IPTG浓度、诱导后培养时间)，表达量可高达200mg／l。由于AqpZ疏水性会导致细胞毒性，随后采用没有生长要求的无细胞蛋白质合成体系。构建的一系列带有不同N端序列的无细胞体系表达载体中，plVEX2．4c．AqpZ为最佳表达载体。由于无细胞体系缺少膜蛋白正确折叠所需要的疏水环境，AqpZ都是以沉淀的形式表达。首先采用去污剂重悬的模式来制备可溶性AqpZ，然而采用的10余种去

3、污剂均不能有效溶解AqpZ沉淀。考虑到无细胞体系的开放性特点，采用直接添加去污剂的模式，发现Brii78为最优去污剂，在112xCMC最佳工作浓度下，可溶表达水平约为530mgA。此外，还研究了直接添加脂质体的模式，在实验最高脂质体浓度(5mg／m1)下，整合到磷脂膜的AqpZ表达水平达到470mg／1。在无细胞体系表达AqpZ时发现，mRNA翻译起始区形成二级结构会抑制翻译的有效启动，使得不带有N端标签的AqpZ表达量较低，所以开展了无细胞体系高效表达AqpZ新策略方面的研究。首先采用双顺反子策略，虽然构建的双顺反子质粒

4、能够有效提高AqpZ在大肠杆菌体系的表达水平，但这些质粒并不能在无细胞体系实现高效表达。随后采用信号肽策略，构建带有不同信号肽序列的AqpZ体外表达载体，目标蛋白在无细胞体系的表达量提高了5倍以上；且通过浙江大学硕士学位论文摘要添加去污剂或者脂质体可以激活无细胞抽提物中的信号肽酶活性，实现信号肽序列的原位切除，说明信号肽序列可以作为促进蛋白翻译的序列元件而发展一个具有普遍意义的、与目的蛋白DNA序列无关的膜蛋白高效表达新策略。关键词：水通道蛋白Z，膜蛋白，融合表达，无细胞蛋白质合成体系，双顺反子质粒，信号肽序列VU浙江大学

5、硕士学位论文摘要AbstractAquaporinZ(AqpZ)，thewaterchannelproteinfromEscherichiacoli，isanorthodoxaquaporinwithhighwaterselectivityandhi曲permeability,makingAqpZ-basedwaterfilterapromisingtoolforwaterreuseandseawaterdesalination．However,thedevelopmentofthisnovelbio-filterisha

6、mperedbytheavailabilityofsufficientamountofwaterchannelproteinssincetheoverexpressionofintegralmembraneproteinsmayexhibittoxicitytowardsthehostduetothehi曲lyhydrophobicnature．TheaimofthisworkistosynthesizefunctionalAqpZathighlevelseitherbyfusionexpressionstrategyor

7、cell—freeexpressionsystem，whichlaysasolidfoundationtOconstructthenovelaquaporin-basedwaterfilter,andalsopromisesauniversalplatformforefficientproductionofmembraneproteins．Firstly,fusionexpressionWaSchosentoimprovetheexpressionlevelofAqpZ．Byfusionwithseveralhydroph

8、ilicparmers，theyieldofAqpZwassignificantlyimproved，andMBPwasdeterminedtobethemostefficientfusionpartnertoincreasetheexpressionlevel．Aftersystematicallyi