大肠杆菌高效表达重组蛋白策略.pdf

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1、万方数据扣国生物上程杂志chinaB埘e“n0109y，2007，27(9)：103～109大肠杆菌高效表达重组蛋白策略+任增亮L2堵国成2’3陈坚L2吴敬卜2”食品科学与技术国家重点实验室江南大学无锡2141222江南大学牛物工程学院无锡214122)(3江南大学工业牛物技术教育部重点实验室无锡214122)摘要大肠杆菌表达系统是基因表选技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。利用该系统表达重组蛋白具有许多优越性，但其表达娃率受诸多因素的影响。综述了国内外利用大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白的策略，主要包括选择合

2、适的启动予、改变信号肚结构、提高mRNA稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解，利用融合蛋白与分子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。关键词大肠杆菌基因工程重组蛋白克隆表达中图分类号Q786表达重组蛋白受许多因素的影响，如菌体生长特性，基因转泶水平，产物到达部位，翻译后修饰过程以及蛋白的修复调控等⋯。虽然一些含复杂二硫键结构或者来源真核生物需要翻译后修饰的蛋白，不能利用E“，“系统21得到高效表达而选择植物细胞、哺乳动物细胞组织。4。和其它微生物宿主，但是火肠杆菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低

3、、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等优点”；，是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的经典表达系统”1，迄今已有大量有关该系统高效表达重组蛋白的研究”o。1表达载体的构建表达载体的构建是实现高效表达的关键步骤。一个完整表达载体包含必需的几个元件(图1)。启动子位于转录起始位点上游一10bp～35bp，受载体自身或宿丰染色体相应的调节基因调控。一个理想的启动子需要具备如下特点：(1)具有强启动性，使重组蛋白达到菌体表达蛋白总量的lO％～30％；(2)必须受调节基因严谨调控。在一定菌体浓度

4、下开始诱导表达，否则，收稿日期：2【107田7一19修叫日期：2007_0801+教育部新世纪人才计划资助项目(吴敬)，江苏省自然科学基金资助项目(BK2【】07019)}女通讯作者，电子信箱：ji“g唧@jlan舶aneducn过量表达外源蛋白尤其是对细胞有毒性的蛋白会严重抑制菌体生长而使蛋白总表达量下降；(3)启动子的诱导要求简便而廉价。现在比较常用的是温度诱导和TPllG诱导”’(表1)。1wG诱导主要应用于基础性研究，由于其毒性和价格昂贵而不能用来生产人类药用蛋白，所以限制了lac和trc启动子的广泛应用。温控

5、型诱导方式简单而且廉价，另外也有改造的启动子如突变的1ac启动子，利用溢度或TwG都可以诱导。sD序列在起始序列上游5～13Im处，可以消除mRNA的电势而提高转录效率。RBs的3’和5’端都富含嘌呤碱基⋯。抗生素标记主要用来筛选重组了和提供选择压，氨苄青霉索抗性标记最常用，但是在生产人类药用蛋自时要考虑其它抗性标记，防止用药过程中出现对青霉素的过敏反应”1。表达载体拷贝数决定于复制起点；使用强启动子和高拷贝质粒会降低宿主细胞的存活力而最终不定能提高目的蛋白的产量。“m等”在目的基凶上游使用双启动子，有效提高了表达量。

6、万方数据104中国生物工程杂志￡hlnaBjotechn0109yV01．27No．92007图1原核表达载体的主要元件组成简图箭头所指为转录^向。在檀糖体结台位点(HBs)中有sf)序列。富含嘌呤．该序列与梭精体】6srRNA的3’一端互补配对．促使核糖体结台到mRNAE，有利f翻译的起始。H船的结台强度取决于sD序列的结构及其与起始密码A[c之间的距离，sD与Auc之间相距一般吼4～10个棱苷豉为佳。阻抑物f{{l弼节基崮编码，调节箍风位于载体或者警台在染色体上。转录终止子(TT)保持mRNA的稳定性。复制起点0n

7、央定质粒拷儿效ng．1SchemaHcpres蚰tationoftllesalientfeaturesandsequ蜘ceekm哪tsofaprokary州cexpre髂．0nvector表1E∞矗常用启动子及特点Table1I。mmdte体u船dfortllehigh-leVeJexpres硝0n0fg蚰髂jnEco矗PmmakrR。gmmlonInductlonPmH㈣k(沁U"1^P，丌u血一h，w—level8xp一】onmlmivetooth⋯y8t⋯；Ie“y81p㈣lonItak，e4㈣ionLcakyc

8、xpms㈣Induc60nc蚰notbepedomledn10wte“pern惴；。anialinduc【ion㈣tbeachieved【舶kv。砷"x万方数据任增亮等：太肠杆菌高效表达重组蛋白簸略105参与降解过程，包括内切核酸酶，(RHaseE，RNaseK，RNaseⅢ)和3’一外切核酸酶(RNaseTI)，在原核中没有发现