在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略

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1、在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主

2、的潜在毒性等等。但知识的大量积累还是有助于为表达方面某些特定的困难提供一般的解决方法。大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。另一方面，许多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物学活性，因而也就可以用大肠杆菌来表达。如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以来，对影响外源基因在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量实验研究，并有多篇归纳性综述发表[1，2，3]。国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了

3、高效表达载体[4]，并在此基础上成功表达了一系列细胞因子的基因[5，6，7]。我们在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行全面的总结，以期有助于我国在这方面的研究。1.有效表达载体的构型构建表达质粒需要多种元件，需要仔细考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。E.coli表达载体的基本结构如图1所示[8]。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassinat

4、ion.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame启动子(以杂和的tac启动子为例)位于核糖体结合位点（RBS）上游10-100bp处，由调节基因（R）控制，调节基因可以是载体自身携带，也可以整合到宿主染色体上。E.coli的启动子由位于转录起始位点上游约35bp的六核苷酸序列（-35区）和一短序列隔开的另一六

5、核苷酸序列（-10区）组成[9,10,11]。有许多启动子可用于在E.coli中的基因表达，包括来源于革兰氏阳性菌和噬菌体的启动子。理想的启动子具有以下特性：作用强;可以严格调控;容易转导入其他E.coli以便筛选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便和廉价的[12]。在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两端限定在-35（±2）和mRNA编码序列的+19到+22之间[13]。Shine-Dalgarno(SD)位点[14,15]在翻译起始阶段与16SrRNA的3’端相互作用[16]。SD与起始密码子间

6、的距离约为5-13bp[17]，而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率[18]。在RBS的5’和3’端均为A丰富区[19]。转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号[20]和组成发卡结构的保护性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解，从而延长mRNA的半衰期[21]。除了上述对基因表达的效率有直接影响的元件以外，载体还含有抗生素抗性基因，以方便质粒的筛选和传代。氨苄青霉素是最常用的抗性标记。但在生产人用治疗性蛋白时，最好选择其他抗性标记(如Tet)以避免可能发生的过敏反应

7、[22]。质粒的拷贝数由复制起点决定。在特殊情况下，选用失控复制子能够获得大量的质粒拷贝数和较高产量的质粒编码蛋白[23，24]。但在另外一些情况下，选用超过pBR322的高拷贝质粒似乎并没有好处。而且已有资料表明，增加质粒的拷贝数降低E.coli中胰酶的产量，在高拷贝质粒中，强启动子的存在严重影响了细胞的活性[25，26]。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhi

8、chliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame转录水平调控1.启动子能在E.coli中发挥作用的启动子很多。这些启动子必须具有适合高水平蛋白质合成的某些特性。首先启动子的作用要强，待表达