在大肠杆菌中高校表达外源蛋白的策略

《在大肠杆菌中高校表达外源蛋白的策略》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略赵军侯云德（病毒基因工程国家車点实验室100052北京）木世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使Z成为向然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中扁密度培养，它的这些特征加上十多年外源棊凶表达的经验使其在大多数科研应用屮成为高效表达异源蛋H最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、腻劝的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、猪主细胞蛋口酶对蛋白质的降解、外源

2、基因和E・co"在密码子利川上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。但知识的人量积累还是有助于为表达方面某些特定的闲难提供一般的解决方法。大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能彖真核蛋口那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋口质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。另一方面，许多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物学活性，因而也就可以用人肠杆菌來表达。如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以來，对影响外源基I大1在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量实验研究，并有多篇归纳性综述发表"'

3、2.-国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了高效表达载体⑷，并在此基础上成功表达了一系列细胞因子的基因6,71o我们在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效农达外源蛋白的策略所涉及的内容进行全而的总结，以期有助于我国在这方而的研究。•有效表达载体的构型构建表达质粒需耍多种冗件，需耍仔细考虑它们的组合，以保证故高水平的蛋白质合成。E.co"表达载体的基本结构如图1所示⑻。mRXA5'UAAGGAGG(N)8AUG(91%)16SrRNA35AUUCCUCCGUG

4、(8%)UUG(1%)启动子（以杂和的tac^动子为例）位于核糖体结合位点（RBS）上游10-100bp处，由调节基因（R）控制，调节基因可以是载体自身携带，也可以整合到宿主染色体上。E.coli的启动子由位于转录起始位点上游约35bp的六核昔酸序列（-35区）和一短序列隔开的另一六核甘酸序列(-10区)组成有许多启动子可用于在E.coli中的基因表达，包括来源于革兰氏阳性菌和噬菌体的启动子。理想的启动子具有以下特性：作川强;可以严格调控;容易转导入具他E.col!以便筛选大量的川丁•牛产蛋白的菌株，而且对其诱

5、导是简便和廉价的⑵。在启动子下游是RBS,其跨度约为54个核昔酸，两端限定在-35(±2)和mRNA编码序列的+19至IJ+22之间⑭。Shine-Daigarno(SD)位点山⑸在翻译起始阶段与16SrRNA的3'端相互作用[叭SD与起始密码子间的距离约为5-13bp[,71,而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率购。在RBS的5'和3'端均为A丰富区3。转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号㉔和组成发卡结构的保护性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解,从而延

6、长mRNA的半衰期呦。除了上述对基因表达的效率有直接影响的元件以外，载体还含有抗牛素抗性基因，以方便质粒的筛选和传代。氨节青每索是最常用的抗性标记。但在生产人川治疗性蛋H时，最好选择其他抗性标记(如九十)以避免可能发生的过敏反应创。质粒的拷贝数由复制起点决定。在特殊情况下，选川失控复制子能够获得大量的质粒拷贝数和较高产量的质粒编码蛋白胁24]o但在另外一些情况下，选川超过PBR322的高拷贝质粒似乎并没有好处。而且已有资料表明，增加质粒的拷贝数降低E.coli中胰酶的产量，在高拷贝质粒中，强启动子的存在严重影响

7、了细胞的活性沁261O•转录水平调控1.丿I；动子能在E.c刃,中发挥作用的启动子很多。这些启动子必须具有适合高水平蛋白质合成的某些特性。首先启动子的作用要强，待表达基因的产物要占或超过菌体总蛋白的的10-30%；第二，它必须表现最低水平的基础转录活性。若要求人量的基因表达，最好选用高密度培养细胞和表现最低活性的可诱导和非抑制启动子。如果所表达的蛋白具有毒性或限制宿主细胞的生长，选用可抑制的启动子则至关垂要；2?，281o例如，伦状病毒的VP7蛋白能有效地杀死细胞，因此必须在严格控制的条件下表达如。但在某些情况

8、下，启动子的严格性并不合理，因为即使最小量的基因产物也能由丁•其毒性而杀死细胞。如能灭活核糖体或破坏膜渗透压的分子对细胞来说是致死性的泗。对宿主的毒性并不仅限于外源基因，某种自身蛋白的过量表达也能造成同样的结果。如编码外膜磷脂蛋白的存基因⑼。另外，不完全抑制的表达系统会造成质粒的不稳定，细胞牛长速度的下降和亜组蛋口产量的降低：32*33IoLanzer和Bujard曾对常用的"c启动子