类人弹性蛋白在大肠杆菌中的高效表达.pdf

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1、第14卷第28期2014年10月科学技术与工程Vo1．14No．280ct．20141671—1815(2014)28—0269—05ScienceTechnologyandEngineering⑥2014Sci．Tech．Engrg．类人弹性蛋白在大肠杆菌中的高效表达赵轶君刘莹薛添魏琪季佳菲陈富林李红民(西北大学生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西省生物技术重点实验室，西安710069)摘要类人弹性蛋白是由VAPGVG六肽重复序列构成的多肽。研究通过全基因合成获得上游引入NcoI和下游引入XhoI限制性内切酶位点的[(

2、VAPGVG)，]基因编码序列，通过定向递归连接技术在pMD19一Tsimple克隆载体中构建[(VAPGVG)]，基因编码序列。利用NcoI和Xhol双酶切从重组克隆载体中回收[(VAPGVG)，]，(ELPs)基因编码序列，在T4DNA连接酶作用下与NcoI和XhoI双酶切处理的线性化载体DNA分子pET28a(+)重组，重组混合物转化大肠杆菌Topl0感受态细胞。从添加有50P-g·mL卡那霉素的LB平板上随机挑取37oC培养过夜的转化克隆，碱法小量抽提质粒DNA，经酶切及序列测定筛选出序列正确的重组质粒DNA转化大肠杆菌BI21(DE3)

3、感受态细胞。从添加有50／xg·mLI1卡那霉素的LB平板上随机挑取37℃培养过夜的转化克隆至新鲜配制的TB液体培养基中，于37℃、200r·minI1培养至0D600约为0．60h，添加终浓度为100g·mL的IPTG诱导类人弹性蛋白表达3h，SDS—PAGE凝胶电泳及Westernblotting分析表明，该研究成功构建了类人弹性蛋白原核表达载体，在IPTG诱导作用下以可溶性状态高效表达。灰度扫描分析显示，重组类人弹性蛋白经IPTG诱导表达3h后，可达宿主细胞可溶性蛋白的28．3％。该工作为以大肠杆菌为表达宿主，大量制备类人弹性蛋白用于生物医

4、学材料奠定了良好的基础。关键词类人弹性蛋白可溶性表达原核细胞生物材料中图法分类号TQ936．16；文献标志码A弹性蛋白(elastin)是存在于肺、皮肤、肌腱、血理化性质及部分生物学特性进行了深入研究。其管和弹性软骨等组织器官胞外基质、相对含量比较后，Meyer等创立了定向递归连接技术构建出类丰富的一种多肽，与微纤维一起赋予这些组织弹性弹性蛋白基因工程多肽，该方法也为人工构建具有和抗张力¨。生理条件下，弹性蛋白的可溶性前体精确分子质量、能够在宿主细胞中按照预先设计的弹性蛋白原(tropoelastin)在赖氨酸氧化酶作用下氧核酸模板精确翻译产生目

5、的多肽创建了一条新化交联、自凝聚而成为极度不可溶蛋白，其弹性、途径。自组装特性、稳定性及生物学活性正H益受到生物类弹性蛋白具有理想的机械特性、化学特性以材料学家的关注。因弹性蛋白高度不溶，研究者及良好的细胞相容性，可在体内自然降解成氨基酸，借助现代分子生物学方法解析了人J、牛L5J、鸡可通过基因工程方法进行高通量生产HJ。但是，等物种的弹性蛋白原基因，发现其疏水域中规律性针对人源弹性蛋白原中规律性出现的六肽重复序列VAPGVG的研究较少，对其功能并不完全清楚，已出现特征性重复序列。最早的类弹性蛋白多肽有的研究表明类人弹性蛋白像人源弹性蛋白一样具(

6、elastin—likepolypeptides，ELPs)是一种在牛的串联有生物学活性，对单核细胞，成纤维细胞，肿瘤细重复序列基础上定义并合成的一种具有弹性且对温胞具有趋化性，可以激活金属蛋白酶的活度敏感的人造多肽聚合物，以五肽串联重复序列单性，J。也有研究显示，不经过任何修饰的类人弹元(Val—Pro—Gly-Xaa-Gly，VPGXG)为基本结构单位，性蛋白(humanelastin—likepolypeptides，hELPs)覆膜x可以是除了脯氨酸以外的任何一种氨基酸J。能够促进细胞黏附特性和增殖能力，有望成为前Urry等化学合成了多种

7、类弹性蛋白多肽并对其景良好的新型生物医学材料。现在开展类人弹性蛋2014年5月13日收到国家基础科学人才培养基金白在大肠杆菌中的高效表达，有助于该蛋白大量制(J1210063)、西北大学“十二五”备方法的建立，为进一步将其制备成组织工程支架“211工程”研究生创新人才培养项目(YZZ12055)、材料奠定基础，对于实现其实际应用具有重要的理陕西省教育厅重点实验室重点科研计划项目(11JS085)论与应用价值。和陕西省科技厅2011年度社会发展攻关项目(2011K1241)共同资助1材料与方法第一作者简介：赵轶君，男，硕士研究生。研究方向：生物工程

8、。E—mail：zyjmobile@163．corn。1．1质粒与菌种270科学技术与工程14卷克隆用质粒载体pMD19一Tsimple