论反相高效液相色谱法测定尿样中维生素c、b 1 和b 2 的浓度

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1、论反相高效液相色谱法测定尿样中维生素C、B1和B2的浓度：李映章张志宇梁晟楠【色谱法　　水溶性维生素和人体的生长发育和健康有着密切关系，在人体的生命活动中具有十分重要的功能，它们在人体内的含量是衡量一个人的健康指标。目前VitC，VitB1和VitB2传统测定方法中，VitC常用2，4-二硝基苯肼比色法和2，6-二氯靛酚钠盐滴定，这两个方法灵敏度较低，特异性差，目前一般科研项目都不采用这个滴定法;VitB1和VitB2可用荧光法，但该法前期处理操纵繁冗，费时费力，其处理方法和过程增加了影响检测精确度欠佳的人为因素。本文数据采用液相色谱法分

2、离检测。　　1实验部分　　1.1仪器SY5000LIQUIDCHROMATOGRAPII（BEIFN）具UV/VIS检测器，色谱柱:LichrosphcrC18，4.6×250，5μm，TL9900色谱数据工作站。　　1.2试剂本实验所用水为石英亚沸蒸馏水，以0.45μm水性微孔滤膜过滤。所用试剂均为分析纯（AR），甲醇为一级色谱纯，标样维生素C、B1、B2储备液以0.01mol/L草酸配制，在4℃冰箱中保存。VitC临用新配。活动相A:0.05ml/LKH2PO4缓冲液（pH6.00）;活动相B:甲醇。均经0.45μm水性微孔滤膜过滤，

3、超声波脱气后使用。整个操纵应避光，且操纵过程要迅速，以防维生素被氧化。　　1.3样品处理检测学生起床后将昨晚尿排空，空腹以200ml水送服VitC500mg，VitB15mg和VitB25mg，然后收集服药后4h内排出的尿于1000ml广口棕色瓶中，并加4%的草酸防护，尿液经0.45μm微孔过滤器过滤［4］，超声波脱气后即可上色谱柱分离检测。　　1.4色谱仪工作条件色谱检测的活动相由磷酸二氢钾A和甲醇B组成，其比例为90∶10和65∶35。流速1.0ml/min，柱温:室温，波长:266nm，柱前压:168～240ATM。　　1.5标准曲

4、线制作配制一系列不同浓度的混合液，经检测得出的数据作出如下3种维生素的标准曲线（如图1示）。　　1.6色谱检测分时间段采样，每采一批样有30个左右尿样。样品处理后，按标准样品检测的条件，以外标法检测VitC、VitB1和VitB2，经TL9900色谱数据工作站处理检测出的数据和图形。　　2检测结果　　经检测，得出样品中所含3种维生素的量，通过分析可得出如下结果（图2为一个样品的VitC、VitB1和VitB23种维生素的色谱分析图）:　　色谱法检测得此样品中VitC、VitB1和VitB2的峰高分别为1805mV、40mV和386mV，从

5、标准曲线计算出其4h内排出尿样中的三种维生素的量分别为2.58mg、0.44mg和0.42mg。从五个斑151个尿样检测结果来看，VitC缺乏的占检测总数的15.23%，不足的占13.90%，正常的占70.87%;VitB1缺乏的占1.99%，不足的占3.31%，正常的占94.70%;VitB2不足的占16.56%，正常的占52.31%，良好的占31.13%（正常以上的占83.44%）［1］。　　3讨论和总结　　3.1检测波长的选择待检测的3种维生素中，VitC在261nm，VitB1在246nm，VitB2在260nm波优点有最大的吸收

6、［2，3］，本次实验曾分别选用以上3种波长检测这三种维生素混合液，以上波长都不是这3种维生素混合液的最大吸收波长，经试验，最后确定266nm波长为三种待检测维生素的最佳检测波长。　　3.2回收率测得人体尿样的3种维生素的含量，再加进已知浓度的标准品，混合后按1.6项操纵，测其含量，得出其均匀回收率的范围是90.12%～99.85%，变异系数在1.98%～6.56%之间，说明此种方法检测人体尿样中的维生素C、B1和B23种水溶性维生素的含量是可靠的。　　3.3活动相确定活动相由磷酸二氢钾缓冲液和甲醇组成，本实验曾以不同比例的活动相和波长对3

7、种维生素C、B1、B2进行反复分离检测。通过实验，终极摸索出检峰形好，保存时间短的活动相组成比例。在磷酸二氢甲缓冲液∶甲醇=90∶10情况下，VitC保存时间在2.280～2.300min之内，VitB1在5.250～5.400min之内，VitB2在20min之后。此种情况分析一个的混合样至少需要25min（含平衡时间）。在活动相比例65∶35的情况下，VitB1保存时间9.120～9.310min。中VitC和VitB1出峰不好，拖尾严重。本实验曾试行以梯度洗脱法检测，可将3种维生素分开，但检测时间长，至少在25min以上，且出现拖尾

8、情况。考虑到本实验要检测的样品数目多，需以尽快的速度检测，故采取分步检测法:在活动相比例90∶10和65∶35情况下分别检测VitC、VitB1和VitB2，两次检测合计不用20min，且它们