浅谈polβ高表达和食管癌细胞耐药的相关性

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1、浅谈polβ高表达和食管癌细胞耐药的相关性【DNA聚合酶β；转染；食管肿瘤；肿瘤细胞，培养的；抗药性，肿瘤；四甲基偶氮唑蓝　　DNA聚合酶beta(polymerasebetagene，polβ)广泛存在于哺乳动物细胞核内，是一条Mr为39×103的单肽链小分子蛋白，由355个氨基酸组成，是目前已知的最小的DNA聚合酶.在碱基切除修复，DNA复制，跨损伤合成中发挥重要功能，还和基因组不稳定性有关［1-4］.近年来的探究表明在多种肿瘤组织及肿瘤细胞株内polβmRNA的表达都明显增加［5-6］.polβ和肿瘤细胞耐药性的关系也逐渐引起人们的注重.本实验通过探究人食管癌顺铂(conce

2、ntrationofcisplatin,cDDP)耐药细胞系Ec9706/cDDP和稳定高表达人野生型polβ的Ec9706细胞中polβ的表达水平及其对抗肿瘤药cDDP的敏感性，旨在进一步探索polβ高表达和食管癌细胞耐药的相关性.　　1材料和方法　　1.1材料　　人食管癌细胞株Ec9706由中国医学科学院肿瘤探究所提供；cDDP山东齐鲁药业股份有限公司产品；RPMI1640培养液Gibco/BRL公司生产；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma产品；pEGFP?C3(Cloech公司)；野生型人polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP?AC3(微生物学和免疫学教研室赵国强教

3、授惠赠)；G418(宝生物公司)；6?TG(美国Sigma公司)；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；引物2对，由上海生工公司合成：polβRNA检测引物：上游5′TGTTTGCCAGCTTCCCAGTA3′，下游5′CTCCAGTGACTCCCAAGGGA3′，扩增长度206bp；β?actin引物:上游5′TCAAGATCATTGCTCCTCCTGA3′，下游5′CTCGTCATACTCCTGCTTGCTG3′，扩增长度113bp.　　1.2方法　　1.2.1cDDP诱导耐药细胞系Ec9706/cDDP的建立　　采用cDDP中等浓度、间歇功能方法

4、建株.以终浓度为2mg/L的cDDP培养基冲击对数生长期的Ec9706细胞，48h后弃往含药培养基，PBS洗3次，换新鲜培养基.1～2d换液1次，洗往死亡细胞，待形成细胞克隆时传代，恢复稳定生长后进步cDDP浓度再次冲击，如此反复功能直至细胞可在浓度为0.5mg/L的cDDP培养液中维持培养.　　1.2.2稳定高表达人野生型polβ的Ec9706细胞系的建立　　取对数生长期Ec9706细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板，待细胞融和度达60%～70%时，以正常Ec9706细胞作对照，分组转染pEGFP?C3(空质粒)和pEGFP?AC3，按转染试剂LipofectamineTM2

5、000操纵说明书进行.4～6h后，弃转染液换2mL含10mL/L胎牛血清的培养液继续培养.48h后以含750mg/LG418的培养液筛选，约14d后对照Ec9706细胞全部死亡，转染组改用含200mg/LG418的培养液，阳性克隆扩大培养后，建立稳定传代转染细胞系.转染pEGFP?C3,pEGFP?AC3的细胞分别用Ec9706?C3,Ec9706?AC3表示.　　1.2.3细胞形态学观察普通颠倒显微镜下观察各组细胞形态，荧光显微镜观察转染后细胞绿色荧光.　　1.2.4RT?PCR检测polβmRNA的表达取细胞各1瓶，按Trizol试剂盒说明书抽提细胞总RNA，逆转录后PCR扩增

6、.PCR反应体系30μL：10×buffer3μL，dNTP2.4μL，上下游引物各0.5μL，Taq酶0.5U，逆转录产物5μL.PCR反应条件:94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环后，72℃延伸5min.15g/L琼脂糖凝胶电泳.SYNGENE凝胶分析系统软件分析电泳结果，用polβ和β?actin积分吸光度值的比值表示polβ基因的相对表达水平.　　1.2.5MTT法测细胞对cDDP敏感性的变化常规MTT法检测，酶标仪以波长550nm测各孔A值，计算相对抑制率（％）＝（1-加药孔A值/对照孔A值）×100％，用IC50计算器软

7、件计算50%细胞生长抑制所需的药物浓度(IC50)，耐药指数(RI)=待测细胞IC50/Ec9706细胞IC50.　　统计学处理：用SPSS10.0统计软件处理数据，数据以x±s表示，t检验，α=0.05.　　2结果　　2.1各组细胞形态　　经过9mo的体外诱导筛选获得了在含0.5mg/L的cDDP培养液中生长良好的耐药细胞系Ec9706/cDDP.诱导过程中在加进cDDP后24h颠倒显微镜下可见大部分细胞因死亡而漂浮起来，培养液略浑浊，残留贴壁细胞发生明显改变，大小